Determinantes estructurales que regulan la función de la isoforma beta de la fosfatidilinositol 4-fosfato 5-kinasa

Abstract

El fosfatidilinositol (4,5) bifosfato (PIP2) es una molécula reguladora de procesos tan importantes como la quimiotaxis. Las principales enzimas que sintetizan PIP2 a partir de fosfatidilinositol 4-fosfato (PI4P) son las fosfatidilinositol 4-fosfato 5-kinasas de tipo I (PIP5KI) cuya familia consta de tres isoformas, α, β, γ y sus variantes de “splicing”. Nuestro grupo ha descrito el papel clave de la isoforma beta (PIP5KIβ) en la polarización y quimiotaxis de leucocitos. Los últimos 4 aminoácidos (DVYL) de su dominio C-terminal constituyen un motivo de unión a dominios PDZ (PSD-95, DLG, ZO-1) que permite la interacción con la proteína EBP50 y la formación de un complejo con Moesina y RhoGDI, necesario para la activación de la GTPasa RhoA en el urópodo celular. La estructura de las PIP5KI no ha sido resuelta hasta el momento y con la excepción del motivo de interacción con Talina en PIP5KIγ_i2, se desconocen los detalles estructurales y conformacionales que regulan la función de las PIP5KI en general, y de la PIP5KIβ en particular. En este trabajo hemos resuelto la estructura cristalográfica del complejo entre la región C-terminal de PIP5KIβ y el dominio PDZ1 de EBP50. Identificamos, a partir de la estructura, los determinantes estructurales de la afinidad y especificidad de esta interacción, lo cual ha permitido modelar, mediante dinámica molecular, mutantes de PIP5KIβ y del dominio PDZ1 de EBP50, y explicar su pérdida de interacción. También hemos modelado la interacción entre la región C-terminal de PIP5KIβ y el dominio PDZ2 de EBP50, estableciendo analogías y diferencias en la interacción con ambos dominios. Hemos identificado ASAP2 como un nuevo “partner” de PIP5KIβ, que explicaría la regulación de las proteínas ARF por esta quinasa lipídica. Estudios de mutagénesis implican la región 110-318 de la PIP5KIβ como importante para la interacción con ASAP2. Esta región de interacción con ASAP-2 es adyacente al dominio de dimerización que hemos identificado en PIP5KIβ. Aunque la homología estructural con las fosfatidilinositol 5-fosfato 4-kinasas (tipo-II) sugería que las PIP5KI podrían dimerizar, esto nunca se había demostrado. Empleando ensayos de co-inmunoprecipitación, espectrometría de masas, ELISA y FRET demostramos que las PI5KI forman homo y heterodímeros tanto in vitro como en células vivas. La mutagénesis dirigida nos permitió identificar el dominio de dimerización de la PIP5KIβ en la hélice-α y la lámina-β de la región N-terminal de la proteína, y los modelos sugieren que la dimerización requeriría la agregación de estas dos estructuras. Los mutantes que no dimerizan apenas poseen actividad enzimática y no se localizan en la membrana plasmática. Nuestros resultados por tanto indican que la dimerización es una característica intrínseca de las PIP5KI capaz modular su actividad enzimática y localización subcelular, e identifican el motivo de dimerización como una región clave en la regulación de la función de estas proteínas.

Phosphatidylinositol (4,5) biphosphate (PIP2) regulates several important cell processes, including chemotaxis. Its synthesis from phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P) is mediated mainly by type I phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinases (PIP5KI). The PIP5KI family comprises three isoforms, α, β, γ, and their splice variants. Our group described a key role for the beta isoform (PIP5KIβ) in leukocyte polarization and chemotaxis. The last four amino acid residues of its C-terminal domain constitute a PDZ domain (PSD-95, DLG, ZO-1) binding motif that allows interaction with the EBP50 protein and therefore, formation of a complex with moesin and RhoGDI, needed for GTPase RhoA activation in the cell uropod. PIP5KI structure has not yet been resolved and, with the exception of the talin-binding motif in the PIP5KIγ_i2 isoform, no structural or conformational details have been defined that explain PIP5KI regulation. In this study, we resolved the crystal structure of the complex formed by the PIP5KIβ C-terminal region and the EBP50 PDZ domain. Affinity and specificity determinants of this interaction were identified from the structure, which allowed us to use molecular dynamics to model some mutants of PIP5KIβ and the PDZ1 domain of EBP50, and thus to explain their loss of interaction. We also modeled the interaction between the PIP5KIβ C-terminal region and the EBP50 PDZ2 domain, and established analogies and differences in the interaction between them. ASAP2 was identified as a new PIP5KIβ partner, which could explain the regulation of ARF proteins by this kinase. Our mutagenesis studies showed that the region comprising PIP5KIβ amino acids 110 to 318 is involved in the interaction with ASAP2; this region is adjacent to the dimerization domain identified in PIP5KIβ. The structural homology of this kinase with phosphatidylinositol 5-phosphate 4-kinases (type II) suggests that PIP5KI forms dimers, although this had not been demonstrated. Here we used co-immunoprecipitation, mass spectrometry, ELISA and FRET assays to demonstrate that the PI5KI form homo- and heterodimers in vitro and in living cells. The PIP5KIβ dimerization domain was identified in the α-helix and β-sheet of the N-terminal region by site-directed mutagenesis. The models suggested that aggregation of these two structures is necessary for protein dimerization. Mutants that did not form dimers showed little enzymatic activity and did not localize to the plasma membrane. Our results suggest that dimerization is an intrinsic characteristic of PIP5KI that modulates their enzyme activity and subcellular localization, and identify the dimerization motif as a key region in the regulation of these proteins