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Meta-genómica aplicada a estudios estructura-función en comunidades microbianas de diferentes sistemas acuáticos
Title (trans.)
Meta-genomic approaches applied to structuralfunctional studies in microbial communities from different aquatic habitatsAuthor
Alcaide López, MaríaAdvisor
Ferrer Martínez, ManuelEntity
UAM. Departamento de Biología Molecular; CSIC. Instituto de Catálisis y Petroleoquímica (ICP)Date
2015-04-24Subjects
Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 24-04-2015Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
This PhD Thesis employs metagenomic tools to identify new versatile enzymes, including esterases,
lipases, glycosidases, aldo-ketoreductases and lactate dehydrogenases. With this Thesis we access to a
wide enzyme diversity by using approaches based on the screening of activities of interest in clone
libraries. The libraries were created from DNA originated from microbial communities of different origin,
that are clearly different from those previously reported in the specialized literature. The main objective is
to achieve through an intensive screen programm to a wide collection of enzymes and to provide an in deep
understanding of the enzyme characteristics on the basis of environmental constraints, as well as of the
mechanisms reponsible for enzyme adaptation and promiscuity. These general objectives have been
achieved through: (1) functional screens in metagenomic libraries in samples with a high and new
microbial diversity with model substrates to access to a high number of positive clones for activities of
interest; (2) in silico screen, in the obtained sequences from positive clones, of those encoding enzymes of
interest; and (3) creating a database containing multiple information that includes sequences, biochemical
data and structural information. The selected enzymes have been biochemically characterized and those
most promising were subjected to high density fermentation and crystallization.
In particular, in the PhD Thesis, we have identified and characterized 25 new enzymes (22
esterases/lipases, 1 beta-glucosidase, 1 aldo-keto reductase, and 1 (L)-lactate dehydrogenase) from
metagenomic libraries created from DNA of microbial communities from 8 different habitats and the
genome of one marine bacterium: i) 4 deep sea basins (Medee, Kryos, Bannock and Matapan) of the
Eastern Mediterranean Sea (3 of which being hypersaline); ii) a karstic lake (Lake Arreo); iii) the
microbiome of the epiotic bacteria from the gill chamber of the deep-sea shrimp Rimicaris exoculata, that
lives close to deep-sea hydrothermal vents (2,320 m depth); iv) superficial seawater contaminated with
crude oil in the Barents Sea (close to Kolguev Island); v) superficial seawater from a hydrothermal vent in
Saint Paul Island (Alaska); and vi) the hydrocarbonoclastic marine bacterium Cycloclasticus sp. ME7. The
temperature, salinity and depth of the investigated habitats range from 4-16.5ºC, 1.1-348 g/kg and 0-4,908
m, respectively. The low accessibility to some the investigated habitats together the unique geochemical
constraints of some of them, make them examples of habitats not previously subjected to enzyme screen
programmes. In addition to that, the differences in temperature, salinity and pressure within them and as
compared to other previously investigated environments make them suitable model habitats to perform
structural-functional studies and to investigate protein adaptation to poly-extreme conditions and analysis
of enzyme properties such as enzyme promiscuity.
The average insert size of the libraries that were subjected to activity screen ranged from 120 to 816
Mbp. The incidence rate of positive clones containing activities of interest varied from 1:667 to 1:15,000.
The molecular mass and isoelectric point of the investigated enzymes varied from 24,190 to 84,278 Da,
and from 4.66 to 10.04, respectively. At the sequence level, the investigated enzymes presented a sequence
homology as compared to known homologous ranging from 25% and 99%. The optimal temperature for
activity range from 12 and 75ºC, and the optimal concentration of salt for activity range from 0 to 4.0 M.
The majority of the enzymes were from bacterial origin of the phylum Proteobacteria (18), followed from
those of Tenericutes (5) and Firmicutes (1); in one case, no unambiguous identification was possible.
The comparative study presented in this PhD Thesis has not only allowed us to provide the widest
collection (25) and crystal structures (6) of enzymes from aquatic environments (including deep sea),
reported to date, but also to provide a wide understanding of the enzyme reactivities and adaptations in a
number of aquatic habitats. In particular, among the most important finding we should mention the
identification and characterization of hydrolases with dual esterase:meta-cleavage product (MCP)
hydrolase, as well as the presence of thermo-active and thermo-stable enzymes in deep-sea environments
where the seawater temperature is never higher than 16.5ºC. In relation to this last point we should
highlight that we have provided first experimental evidences that link the resistance of enzymes to high
temperature and pressure in deep-sea hypersaline habitats. Moreover, the extensive analysis of substrate
profiles tested with at least 210 substrates provided a deep understanding of promiscuity of the different
enzymes investigated within them and as compared to other reported ones in the specialized literature. The
results points to rare enzyme substrates profiles of some of the enzymes herein reported, some of which
may have biotechnological potential. The data also suggests that enzymes from the same habitat may have
similar reactivities as compared to those from other habitats. La presente tesis Doctoral emplea técnicas metagenómicas para la identificación de enzimas novedosas
y versátiles, que incluyen esterasas/lipasas, glicosidasas, aldo-ceto reductasas y lactato dehidrogenasas. A
través de esta Tesis se ha accedido a una amplia diversidad enzimática mediante el uso de estrategias de
rastreo de actividad enzimática en librerias de clones. Dichas librerías se han creado a partir de DNA
extraído de comunidades microbianas de diferente procedencia, que se distinguen claramente de otros
trabajos realizados con anterioridad en la literatura científica. El objetivo principal es proporcionar a través
de rastreos enzimáticos una amplia colección de enzimas, y un entendimiento detallado de las
carácterísticas de las mismas en el marco de las condiciones geoquímicas que caracterizan los hábitats de
procedencia, y los mecanismos subyacentes a la actividad de las enzimas. Estos objetivos ambiciosos se
han conseguido mediante el empleo de: (1) rastreos funcionales de librerias metagenómicas empleando
muestras de alta y muy diferente biodiversidad con sustratos modelo para acceder a un mayor número de
clones positivos; (2) rastreos en las secuencias obtenidas de los clones positivos de secuencias
correspondientes a las enzimas objeto de estudio; y (3) una amplia base de datos de secuencias, y datos
bioquímicos y estructurales de las enzimas estudiadas. Las enzimas selecciondas han sido caracterizadas
bioquímicamente y aquellas más prometedoras se sometieron a fermentaciones con alta densidad celular y
técnicas de modelado y cristalización.
En particular, en la presente Tesis Doctoral se han identificado y caracterizado 25 nuevas enzimas (22
esterasas/lipasas, 1 beta-glucosidasa, 1 aldo-ceto reductasa, y 1 (L)-lactato dehidrogenasa) de metagenomas
creados a partir de DNA de comunidades microbianas procedentes de 8 hábitats diferentes y un genoma de
una bacteria cultivable. En particular de: i) cuatro fosas marinas (Medee, Kryos, Bannock y Matapan) del
Este del Mar Mediterráneo (3 de ellas hipersalinas); ii) un lago cárstico (Lago Arreo); iii) el microbioma de
agallas de una gamba (Rimicaris exoculata) que viene a 2,320 m de profundidad en la zona cercana a un
fuente hidrotermal en la Dorsal Mesoatlántica; iv) agua marina superficial contaminada con crudo cercana
a la Isla de Kolguev en el Mar de Barents; v) una fuente hidrotermal no profunda en la Isla de San Pablo
(Alaska); y vi) de la bacteria marina hidrocarbonoclástica, Cycloclasticus sp. ME7. La temperatura,
salinidad y profundidad de los hábitats estudiados oscila entre 4-16.5ºC, entre 1.1 y 348 g/kg y entre 0 y
4,908 m, respectivamente. Las características geoquímicas de estos hábitats los convierten en ejemplos de
ambientes poco explorados a nivel enzimático y la amplia diversidad de factores ambientales, en particular,
salinidad, temperatura y presión, los conviertes en hábitats adecuados para estudios estructura-función,
adaptaciones a medios extremos y análisis de promiscuidad catalítica.
El tamaño medio de las librerías sometidas a rastreos funcionales oscila entre 120 y 816 Mbp, y el
número de clones positivos para las actividades de interés por genoteca oscila entre 1:667 a 1:15,000. La
masa molecular y el punto isoeléctrico de las enzimas estudiadas oscila entre 24,190 y 84,278 Da, y 4.66 y
10.04, respectivamente. A nivel de secuencia las enzimas identificadas y analizadas presentan homología a
nivel de identidad entre el 25% y el 99%. La temperatura óptima de actividad oscila entre los 12 y los 75ºC
y las concentraciones de sal (NaCl) para actividad óptima varían entre 0 y 4.0 M. La mayoría de las
enzimas proceden de bacterias del filo Proteobacteria (18), seguido de Tenericutes (5) y Firmicutes (1); en
uno de los casos, no fue posible sugerir la posible bacteria de origen.
El estudio comparativo de las enzimas identificadas no solo ha proporcionado la mayor colección (25) y
mayor número de estructuras (6) de enzimas de ambientes acuáticos (incluídos ambientes marinos
profundos), sino también un amplio conocimiento de nuevas reactividades y adaptaciones de las mismas.
En particular conviene destacar la identificación y caracterización de enzimas con actividad dual esterasa:
C-C hidrolasa, así como la presencia de enzimas termo-activas y termo-resistentes en ambientes marinos
profundos donde la temperatura no es superior a 16.5ºC. Los datos presentados en esta Tesis Doctoral
demuestran una relación directa entre la resistencia a la presión y un aumento en la temperatura óptima y
de desnaturalización en enzimas de microorganismos aislados de ambientes marinos profundos hipersalinos.
Así mismo cabe mencionar que el análisis exhaustivo de las reactividades con un set de más de
210 sustratos ha proporcionado un amplio conocimiento de los niveles de promiscuidad de las enzimas de
diferentes hábitats entre sí y con enzimas comerciales y descritas en la literatura científica. Los resultados
presentados en esta Tesis Doctoral no solo apuntan a la existencia de especificidades inusuales de interés
biotecnológico, sino también indican que las enzimas de un mismo hábitat presentan, por lo general,
reactividades parecidas
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Anexo 1. Material complementario del capítulo 2
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Anexo 2. Material complementario del capítulo 4
Google Scholar:Alcaide López, María
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