Estudios genéticos, fisiopatológicos y con oligonucleótidos antisentido en enfermedades neurometabólicas

Abstract

In this work, we have characterized the molecular basis of the defect in fibroblasts samples from 10 patients diagnosed with propionic acidemia (PA), one of the most common organic acidemias. In addition, we have investigated oxidative stress and cellular damage in PA patients´ fibroblasts. Furthermore, using the hypomorph mouse model of PA we have characterized the mitochondrial dysfunction and oxidative damage and studied the behavior and motor coordination. Finally, we have tested in vivo the efficiency of splice-modulation using antisense oligonucleotides (AONs), which are a promising therapy for specific splicing defects. To provide molecular insight into the pathogenicity of PA variants we have analyzed the structural and functional effects of five point mutations in PCCA and PCCB genes, by using homology modeling with the recently solved crystal structure of the PCC holoenzyme and an eukaryotic expression system. The results confirmed the pathogenic nature of these mutations, showing a more severe effect in those ones located near the active site in the a subunit compared to mutations located between b subunits that showed higher residual PCC activity. We have performed in silico and functional analysis using minigenes to analyze a point mutation in the last nucleotide of the exon 7 of the PCCB gene, revealing it is a partial splicing defect and underscoring the need of carefully evaluating every nucleotide change for a possible splicing defect. Moreover, we have investigated oxidative stress analyzing intracellular ROS levels, antioxidant enzymes´ levels and apoptosis parameters in PA patients-derived fibroblasts. Our results indicate that oxidative stress may be an important contributing factor to the cellular damage. Additionally, we have shown that different antioxidants successfully scavenge ROS production in these patients´ cells. These results establish the proof of concept of the potential of antioxidants as an adjuvant therapy for PA. To gain further insights into the physiopathology of PA, we have used the mouse model of PA to study the expression of several proteins involved in mitochondrial function by Reverse Phase Protein Microarrays (RPPMa), OXPHOS activities, mtDNA copy number and oxidative damage. The results showed impairment of oxidative phosphorylation, increased ROS production, lipid peroxidation and mtDNA depletion in relevant tissues. To characterize behavioral and locomotive defects, we have carried out open-field test and rota-rod performance. The results indicate age-dependent alterations in locomotion, coordination and endurance. These data support the hypothesis that mitochondrial dysfunction may contribute to the physiopathology of PA. Finally, in the heterozygous PKU mouse model and in wildtype mice we have tested AONs using different dosing, mode of injection and treatment regimes. The results showed that consecutive intravenous injections of optimal doses result in transient hyperphenylalaninemia correlating with complete exon skipping and absence of PAH protein and enzyme activity. These results provide a sensitive in vivo assay to test the ability of AONs to modulate splicing, as well as a possible method to generate murine models for genetic liver diseases

En este trabajo, se han caracterizado algunas mutaciones identificadas en fibroblastos de 10 pacientes diagnosticados con acidemia propiónica (AP), una de las acidemias orgánicas más comunes. Además, se ha investigado el estrés oxidativo y el daño celular en los fibroblastos de estos pacientes. Asimismo, utilizando el modelo hipomorfo murino de AP se ha caracterizado el daño oxidativo y la disfunción mitocondrial y estudiado el comportamiento y la coordinación motora. Por último, se ha probado la eficiencia in vivo de la modulación de splicing mediante el uso de oligonucleótidos antisentido (AONs), que constituyen una terapia prometedora para los defectos específicos de splicing. Para proporcionar un mejor entendimiento molecular de la patogenicidad de variantes en AP se ha analizado el efecto estructural y funcional de cinco mutaciones puntuales en los genes PCCA y PCCB, mediante el modelado por homología de la estructura cristalina recientemente resuelta de la holoenzima PCC y un sistema de expresión eucariota. Los resultados confirmaron la naturaleza patogénica de estas mutaciones, que muestran un efecto más severo en aquellas variantes situadas cerca del centro activo en la subunidad α en comparación con mutaciones localizadas entre las subunidades β que mostraron una mayor actividad PCC residual. Se ha llevado a cabo el análisis in silico y funcional empleando minigenes para analizar una mutación puntual en el último nucleótido del exon 7 del gen PCCB, mostrando un defecto de splicing parcial que subraya la necesidad de evaluar cuidadosamente todos los cambios nucleotídicos como posibles defectos de splicing. Por otra parte, se ha investigado el estrés oxidativo analizando los niveles intracelulares de ROS y de enzimas antioxidantes y parámetros relacionados con la apoptosis en los fibroblastos de pacientes con AP. Nuestros resultados indican que el estrés oxidativo puede ser un importante factor que contribuye al daño celular. Además, se ha demostrado con éxito que diferentes antioxidantes neutralizan la producción de ROS en las células de estos pacientes. Estos resultados establecen la prueba de concepto del posible uso de antioxidantes como una terapia adyuvante en AP. Para obtener un mayor conocimiento en la fisiopatología de la AP, se ha utilizado el modelo de ratón de AP para estudiar la expresión de varias proteínas implicadas en la función mitocondrial mediante microarrays de proteínas de fase reversa, midiendo las actividades OXPHOS, el número de copias de DNA mitocondrial y el daño oxidativo. Los resultados mostraron una alteración en la fosforilación oxidativa, un aumento de la producción de ROS y de lipoperoxidación y una depleción de DNA mitocondrial en tejidos relevantes. Para caracterizar defectos locomotores y de comportamiento, se han llevado a cabo pruebas de campo abierto y pruebas de rota-rod. Los resultados sugieren alteraciones dependientes de la edad en la locomoción, la coordinación y la resistencia. Todos estos datos apoyan la hipótesis de que la disfunción mitocondrial puede contribuir a la fisiopatología de la AP. Finalmente, se han contrastado diferentes dosis, modos de inyección y pautas de administración de oligonucleótidos antisentido en el modelo de ratón PKU heterocigoto y en ratones wildtype. El estudio mostró que inyecciones intravenosas consecutivas de dosis óptimas resultan en una hiperfenilalaninemia transitoria que se correlaciona con un completo exon skipping y con la ausencia de proteína y actividad enzimática PAH. Estos resultados proporcionan un ensayo eficaz in vivo para probar la capacidad de los AONs para modular el splicing, así como un posible método para generar modelos murinos para enfermedades genéticas hepáticas.