Generación y caracterización de anticuerpos frente al receptor de quimioquinas CCR9 humano: Evaluación de su potencial para inmunoterapia antitumoral
Author
Vela Cuenca, MaríaEntity
UAM. Departamento de Biología MolecularDate
2015-04-17Funded by
Este trabajo ha sido realizado en el laboratorio de la Dra. L. Kremer, en el Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), en el marco de Proyectos de Investigación en Salud del ISCIII (Ref. PI10/00594 y PI14/00703) financiados con fondos FEDER y del PN de I+D+I y siendo Investigador Principal LK. Los contratos de María Vela Cuenca se financiaron con fondos de dos Proyectos Intramurales del CSIC, dirigidos por LK (Ref. 201120E007 y 201320E109)Subjects
Aftovirus - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17-04-2015Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
El uso de anticuerpos terapéuticos para el tratamiento del cáncer ha experimentado un
crecimiento exponencial en los últimos años, al permitir el desarrollo de tratamientos
muy específicos y de baja toxicidad. Muchos de estos anticuerpos reconocen antígenos
presentes de forma selectiva en la superficie de las células tumorales. Este es el caso del
receptor de quimioquinas CCR9, implicado en la retención en el timo de las células T en
desarrollo y en el reclutamiento de leucocitos al intestino delgado, donde se expresa su
ligando, la quimioquina CCL25. En adultos, tras la involución del timo, la expresión de
CCR9 es muy limitada, reduciéndose a células del sistema inmune que infiltran la
mucosa intestinal y a un 3-4% de los leucocitos circulantes. Se ha descrito la expresión
de este receptor en distintos tipos de neoplasias, incluyendo leucemias linfocíticas
agudas de células T, metástasis de melanomas, cáncer de mama y adenomas de colon.
Por estos motivos, se considera a CCR9 como una diana atractiva para el diseño de
nuevos agentes terapéuticos antitumorales.
En este trabajo se describe la generación y caracterización de dos anticuerpos
monoclonales (mAb) específicos de CCR9 humano, denominados 91R y 92R, obtenidos
mediante inmunización génica. Estos mAb reconocen al receptor en su conformación
nativa y se unen a un mismo epítopo, presente en el dominio N-terminal extracelular de
CCR9 entre sus aminoácidos 11 y 16 (aa 11-16). 91R y 92R se unen con alta afinidad (KD
entre 1 y 2 nM) a un péptido sintético que contiene dicho epítopo. Los dos mAb podrían
estar relacionados en su origen, ya que presentan una elevada identidad de secuencia de aa
de sus regiones variables, del 95% en las cadenas pesadas y del 89% en las ligeras.
Disponer de estas secuencias de aa ha permitido la modelización bioinformática de la
estructura del complejo 91R-CCR9 y la identificación de los aa más implicados en esta
interacción. La información extraída de estos modelos ha sido confirmada
experimentalmente, utilizando un panel de péptidos sintéticos, observándose que los aa
Asn12 y Asp16 del epítopo CCR9(11-16) son imprescindibles para que se produzca la
interacción antígeno-mAb.
Los estudios realizados in vitro e in vivo demostraron que los mAb 91R y 92R presentan
una potente actividad antitumoral frente a células CCR9+. Los dos mAb son capaces de
promover la lisis, mediada por el complemento y por células citotóxicas, de células MOLT-
4 de leucemia linfocítica aguda de células T. En modelos xenogénicos de ratones BALB/c
Rag2-/-, estos mAb inhiben eficazmente el crecimiento de tumores subcutáneos de células
MOLT-4. Cuando el tratamiento con mAb se inicia al día siguiente de la inoculación de las
células tumorales, los mAb 91R y 92R reducen el crecimiento de los tumores en un 91% y
en un 100%, respectivamente. Además, 91R es capaz de inhibir en un 64% el tamaño de
los tumores cuando se administra 7 días después de la inoculación tumoral, y en un 85%
cuando el número de dosis de mAb se reduce a la mitad. Se ha observado que la
disminución del tamaño de los tumores en los ratones tratados con 91R se correlaciona
con un aumento en el nivel de necrosis y de apoptosis, y con una disminución del número
de células proliferantes y de la angiogénesis intratumoral.
Finalmente, se ha analizado la expresión de CCR9 en muestras de tumores humanos de
diferentes orígenes. Se ha observado la expresión de CCR9 en algunas neoplasias
hematológicas de células B, lo que permite incluir a este tipo de patologías entre las que
podrían beneficiarse de un tratamiento con agentes dirigidos frente a CCR9. En
resumen, los mAb descritos en este trabajo presentan elevado potencial como agentes
terapéuticos contra el cáncer The use of therapeutic antibodies for the treatment of cancer has grown exponentially
in recent years since they combine high specificity and low toxicity. Many of these
antibodies recognize antigens present selectively on the surface of tumor cells. This is
the case of chemokine receptor CCR9. This receptor is involved in the retention of
developing T cells in the thymus and in the recruitment of leukocytes into the small
intestine, where its ligand, the chemokine CCL25, is expressed. In adulthood, after
thymus involution, CCR9 expression is very limited. It is restricted to infiltrating
immune cells in the intestinal mucosa and 3-4% of circulating leukocytes. It has been
described the expression of this receptor in various types of neoplasias, including Tcell
acute lymphocytic leukemias, metastatic melanomas, breast cancer and colon
adenomas. For these reasons, CCR9 is an attractive target for the design of new antitumor
therapeutic drugs.
Here, we describe the generation and characterization of two monoclonal antibodies
(mAb) specific to human CCR9, termed 91R and 92R, obtained by gene immunization.
These mAb recognize the receptor in its native conformation and bind to a common
epitope, present in the N-terminal extracellular domain of CCR9, amino-acids 11-16
(aa 11-16). 91R and 92R have high binding affinity to a synthetic peptide containing
such epitope, with KD between 1 and 2 nM. Both mAb could be related in their origin,
since they have high aa sequence identity of its variable regions, 95% for its heavy
chains and 89% for its light chains. These aa sequences allowed the bioinformatics
structure modeling of CCR9-91R complex and the identification of the key aa
responsible for this interaction. The information obtained from these models has
been confirmed experimentally, using a panel of synthetic peptides, observing that
Asp16 and Asn12 aa within CCR9(11-16) epitope are essential for the antigen-mAb
interaction.
In vitro and in vivo studies showed a potent antitumor activity against CCR9+ cells of
91R and 92R mAb. Both mAb are able to promote complement mediated- and
cytotoxic cells-mediated lysis of acute T-cell lymphocytic leukemia MOLT-4 cells. In
BALB/c Rag2-/- mice xenogeneic models these mAb effectively inhibited the
subcutaneous growth of MOLT-4 cells tumors. When mAb treatment begins on day 1
after tumor cells inoculation, the mAb 91R and 92R reduce the growth of tumors by
91% and 100%, respectively. Moreover, 91R is able to inhibit by 64% the size of
tumors when administered 7 days after tumor inoculation, and 85% when the number
of mAb doses are halved. It has been observed that the reduced size of tumors in 91Rtreated
mice correlates with an increase in the level of intra-tumor necrosis and
apoptosis, and decreased number of proliferating cells and angiogenesis.
Finally, we analyzed the expression of CCR9 in human tumor samples from different
origins. CCR9 expression was found in certain B-cell hematological neoplasias
allowing the inclusion of this type of pathologies among those that could benefit from
treatments with agents directed against CCR9. In summary, the mAbs described in
this study have high potential as therapeutic agents against cancer
Files in this item
Google Scholar:Vela Cuenca, María
This item appears in the following Collection(s)
Related items
Showing items related by title, author, creator and subject.
-
Generación y caracterización de anticuerpos multivalentes y multiespecíficos basados en dominios de trimerización derivados del colágeno humano
Alvarez de Cienfuegos Suárez-Inclán, Ana
2013