The toxin-antitoxin εζ system: Role of ζ toxin in regulating ATP, GTP, (p)ppGpp and uridine diphosphate N-acetylglucosamine pool to cope with stress
Author
Tabone, MariangelaAdvisor
Alonso Blanco, CarlosEntity
UAM. Departamento de Biología Molecular; CSIC. Centro Nacional de Biotecnología (CNB)Date
2015-10-27Subjects
Toxinas - Tesis doctorales; Antitoxinas - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 27-10-2015Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
The toxin-antitoxin (TA) systems are compact modules, usually comprising a pair of
genes coding for a toxin and its cognate antitoxin. These systems are present in the
chromosomes of Bacteria, Archaea, in phages and in the large majority of low copy
number plasmids. Basically, toxins are proteins whose activity usually leads to the
inhibition of cell proliferation by interfering with cellular processes such as DNA
replication, translation, cell division, membrane biosynthesis or ATP synthesis. Toxins
of the ζ family (ζ, PezT, etc.) are one the most ubiquitous in nature. In B. subtilis the
expression of the ζ toxin at or near physiological concentrations induces a state of
dormancy, which can be reversed by de novo synthesis of the homodimeric ε antitoxin,
lyses a small fraction of cells and leaves a subpopulation (as little as 10-4) refractory or
tolerant to the toxin action. Here we studied the type of dormancy induced by the toxin
and by different antimicrobial agents. We show that the combined action of ζ and
different antimicrobial agents (Amp, Van, Fos, Tri, Cip, Ery) does not increase the
number of tolerant cells. Indeed the toxin ζ enhances the efficacy of the antimicrobial
agents used and thus potentiates cell killing, suggesting that there are more than one
way to induce dormancy. In E. coli deletion of monofunctional RelA is necessary to
reduce the proportion of tolerant cells. Conversely in B. subtilis the deletion of the
bifunctional RelA, and the presence of low uncontrolled (p)ppGpp levels leads to hypertolerance
of toxin and/or of antimicrobials. Physiological or low (p)ppGpp levels (as in
wild type, sasA-, sasB- and relA- sasA-) show a normal toxin and antimicrobial tolerance
and lower (p)ppGpp levels (relA- sasB-) or absence of (p)ppGpp (relA- sasA- sasB-) in
concert with elevated GTP levels, potentiate the efficacy of both the toxin and the
antimicrobial action, rendering tolerance vulnerable to eradicate. Reduction of the GTP
levels overcomes this phenotype. In vitro experiments reveal that the ζ toxin
phosphorylates the Uracil-N-acetylglucosamine (UNAG), leading to unreactive UNAG-
3P. In silico analysis suggest that the phosphotransfer reaction is uncoupled to the ATP
hydrolysis. Biochemical analysis reveals that in vitro ζ toxin is a strong UNAGdependent
ATPase and phosphorylates only a fraction of UNAG. Indeed, in vivo
experiments show that the ζ toxin does not deplete the (UNAG) pool, because
expression of the ζ toxin enhances the efficacy of genuine cell wall inhibitors, which act
in the following step of the peptidoglycan biosynthesises (Fos, Amp and Van).
Mutagenesis of several amino acids of the ζ toxin indicated that the residues D67, E100,
E116, R158 and R171 are important for the binding of the protein with the UNAG, ATP
and Mg++ and for its mechanism of action. The ζ toxin reduces the nucleotide pool
(ATP and GTP) and indirectly “macromolecule synthesis” rendering cells
“metabolically inactive”
. Los sistemas toxina-antitoxina están formados por dos componentes: una toxina de
larga vida media y una antitoxina, con una vida media mucho más corta. Estos sistemas
se encuentran en los cromosomas de las Bacterias, Archaea, en fagos y en la gran
mayoría de los plásmidos de bajo número de copia. Las toxinas son proteínas que
inhiben el crecimiento celular, interfieren en la replicación del ADN, la traducción, la
división celular, la biosíntesis de la membrana y la síntesis de ATP. Las toxinas de la
familia ζ (ζ, PezT, etc.) son una de las toxinas más extendidas en la naturaleza. En B.
Subtilis concentraciones fisiológicas de la toxina ζ inducen un estado de inactividad,
que puede ser revertido mediante la síntesis de novo de homodimeros de la antitoxina ε2.
También lisa una pequeña fracción de las células y deja una subpoblación (del orden de
10-4) tolerante a la acción de la toxina. En esta tesis doctoral se estudió el tipo de
tolerancia inducida por la toxina y la tolerancia inducida por distintos agentes
antimicrobianos. Se ha demostrado que la acción combinada de la toxina ζ junto con la
acción de diferentes agentes antimicrobianos (Amp, Van, Fos, Tri, Cip, Ery) no
incrementa el número de células tolerantes sino que aumenta la eficacia de los agentes
antimicrobianos utilizados, potenciando la muerte celular. Estos datos sugieren que hay
más de una vía para inducir el estado de tolerancia. En E. coli la supresión de la enzima
monofuncional RelA es necesaria para reducir la proporción de células tolerantes. Sin
embargo en B. Subtilis la inactivación de la enzima bifuncional RelA, y la presencia de
niveles bajos y “desregulados” de (p)ppGpp conduce a la hipertolerancia hacia la toxina
y/o de los antimicrobianos. Niveles bajos o fisiológicos de (p)ppGpp (cepa silvestre,
sasA-, sasB- y relA -sasA-) muestran una tolerancia normal tanto a la toxina cuanto a los
agentes antimicrobianos. Niveles muy bajos (relA-sasB-) o ausentes (relA -sasB- sasA-)
juntos con altos niveles de GTP potencian el efecto tanto de la toxina como de los
agentes antimicrobianos, lo que hace que la tolerancia sea vulnerables a la erradicación.
La reducción de los niveles de GTP revierte esto fenotipo. En experimentos in vitro se
ha visto que la toxina ζ fosforila el Uracil N-acetilglucosamina (UNAG), conduciendo a
la formación de un substrato no reactivo (UNAG-3P). El análisis in silico sugiere que la
reacción de fosfotransferencia está desacoplada con la hidrólisis del ATP. El análisis
bioquímico reveló que in vitro la toxina ζ es una ATPasa dependiente del (UNAG) y
que fosforila solo una fracción de UNAG. Además, en experimentos in vivo se ha visto
que la toxina ζ no agota las reservas de UNAG, porque su expresión mejora la eficacia
de los inhibidores de la pared celular (Fos, Amp y Van) que actúan en las siguientes
etapas de la biosíntesis del peptidoglicano. La mutagénesis de varios aminoácidos de la
toxina ζ indicó que los residuos D67, E100, E116, R158 y R171 son importantes para la
unión de la proteína con el UNAG, ATP y Mg++ y para su mecanismo de acción. La
toxina ζ reduce la reservas de ATP y GTP, e indirectamente la síntesis de
macromoléculas dejando las células metabólicamente inactivas
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