Characterization of human adenovirus assembly: Structural studies in the cell and in purified incomplete viral particles
Advisor
San Martín Pastrana, CarmenEntity
UAM. Departamento de Biología MolecularDate
2015-11-26Subjects
Adenovirus - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 26-11-2015Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
Los Adenovirus (AdV) se encuentran entre los más complejos de los virus icosaédricos carentes
de membrana. Incluso después de resolverse su estructura a resolución cuasi-atómica tanto
por crio-microscopía electrónica (crio-ME) como por cristalografía de rayos X, la localización de
las proteínas minoritarias de la cápside es aún objeto de controversia. La compleja
arquitectura de la cápside es producto de un complicado proceso de ensamblaje, del cual
muchos aspectos no han sido clarificados. En particular, no se sabe si los procesos de
encapsidación del genoma y ensamblaje ocurren de forma secuencial o concertada. Dos
estrategias para estudiar el mecanismo de ensamblaje son: el estudio de partículas de baja
densidad purificadas (consideradas intermediarios de ensamblaje), y el seguimiento de las
proteínas estructurales y el genoma viral hasta su ensamblaje en células infectadas. En la
primera parte de esta tesis, se analizan células infectadas con AdV tipo 5 (Ad5) wild type (wt) a
diferentes tiempos de infección y se comparan con un mutante de Ad5 (Ad5/FC31), con un
retraso en el proceso de encapsidación. Se realizaron ensayos de inmuno-fluorescencia e
inmuno-microscopía electrónica para determinar la localización del ADN viral y las proteínas
de encapsidación, core y cápside en células infectadas. Los resultados indican que todos los
factores de ensamblaje se localizan en un área previamente descrita como la zona periférica
de replicación, la cual sería la factoría de ensamblaje de AdV. Los intermediarios de ensamblaje
observados en esta área apoyan el modelo de ensamblaje y encapsidación concertados. El
ensamblaje podría dividirse en dos rutas: una sólo para proteínas de la cápside, y otra sólo
para el ADN viral y proteínas del core. Solamente cuando ambas rutas están acopladas por la
interacción correcta entre proteínas encapsidadoras y componentes del core, se producen las
partículas virales completas. La mutación Ad5/FC31 desacopla estas rutas generando cápsides
vacías y cuerpos moteados, que son acumulaciones de cores. En la segunda parte de la tesis, la
caracterización molecular y estructural de las partículas ligeras de Ad5/FC31 reveló que estas
partículas carecen de genoma viral y proteínas del core, pero habían iniciado la encapsidación
y maduración sugiriendo que son productos abortivos de ensamblaje. La estructura de estas
partículas ligeras analizadas por crio-ME muestra por primera vez la localización de la proteína
L1 52/55 kDa dentro de la cápside, y cómo ésta cambia durante la maduración. Finalmente,
estas estructuras ayudan a resolver la controversia actual acerca de la localización de las
proteínas minoritarias de la cápside Adenovirus (AdV) is one of the most complex icosahedral, nonenveloped viruses. Even after its
structure was solved at near atomic resolution by both cryo-electron microscopy (cryo-EM)
and X-ray crystallography, the localization of minor coat proteins is still a subject of debate.
The elaborated capsid architecture is the product of a correspondingly complex assembly
process, of which many aspects remain unclear. In particular, it is still not settled if assembly
and packaging occur in a sequential or concerted manner. Two strategies to investigate the
assembly mechanism are: studying purified light viral particles, which are considered assembly
intermediates, and following the structural proteins and viral genome fate until their assembly
in infected cells. In the first part of this thesis, cells infected with AdV type 5 (Ad5) wild type
(wt) were studied at different post-infection times and compared with an Ad5 mutant
(Ad5/FC31), which has a delay in the packaging process. Immunofluorescence and
immunoelectron microscopy assays were carried out to determine the localization of viral
DNA, packaging, core and capsid proteins in infected cells. The results indicate that all
assembly factors can be found in an area previously recognized as the peripheral replicative
zone, which could therefore be the AdV assembly factory. Assembly intermediates observed in
this region support the concerted assembly and packaging model. The assembly process could
be divided in two pathways, one for only capsid proteins and another one for viral DNA and
core proteins. Only when both pathways are coupled by correct interaction between
packaging proteins and genome, the viral particle is produced. The mutation in Ad5/FC31
decouples these pathways generating empty capsids and speckled bodies, which are
accumulations of unpackaged cores. In the second part of this thesis, the molecular and
structural characterization of Ad5/FC31 light particles revealed that these particles lack
genome and core proteins, but had started packaging and maturation, suggesting that they are
assembly dead ends. The cryo-EM structures of the Ad5/FC31 light particles provide the first
glimpse on the organization of packaging protein L1 52/55 kDa inside the capsid shell, and how
this organization changes during maturation. Finally, the cryo-EM structure also helps to settle
the controversy regarding localization of the minor coat proteins
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Google Scholar:Condezo Castro, Gabriela Nérida
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