Análisis de los cambios de expresión génica asociados a las alteraciones en la disponibilidad de colesterol

Abstract

El colesterol es una molécula fundamental en la fisiología celular por su función estructural en la membrana celular, por ser precursor de hormonas esteroídicas y ácidos biliares y por su papel regulador en distintos procesos celulares. Además, nuestro grupo ha demostrado que el colesterol es esencial para la progresión del ciclo celular. El principal mecanismo de regulación del contenido celular de colesterol es el control de la trascripción génica, llevada a cabo mediante la vía de los SREBPs. En el presente trabajo nos propusimos estudiar los cambios de expresión génica producidos por la alteración de la disponibilidad celular de colesterol, con el objetivo de identificar nuevos genes que responden al mismo. Para ello, utilizamos el CholestchipTM, un microarray “dirigido” al estudio de los genes implicados en el metabolismo lipídico y en el ciclo celular. En primer lugar, determinamos que el método de normalización de los resultados que mejor se ajustaba a nuestras condiciones experimentales era el método de LOWESS por calibradores. A continuación, estudiamos los cambios de expresión producidos por el tratamiento de las células HL-60 con el inhibidor de la síntesis de colesterol SKF104976, y la posterior reposición del mismo en forma Col-MBCD (colesterol acomplejado con metil--ciclodextrina) o de LDL. Encontramos que dicho inhibidor estimulaba la expresión de la mayoría de los genes implicados en la síntesis de colesterol, que son dianas de SREBP, y que este efecto se revertía rápidamente tras la adición de Col-MBCD. Sin embargo, el efecto de las LDL era más lento. La expresión de algunos genes de la síntesis de ácidos grasos también se incrementó con el SKF104976 y se redujo al añadir colesterol. Además, el SKF104976 reprimía diversos genes del ciclo celular, como SKP2, PLK y CDC20, mientras que el colesterol recuperaba su expresión, todo lo cual era coherente con los efectos observados sobre la progresión del ciclo celular. La inhibición de la expresión de estos genes se asociaba a la acumulación de células tetraploides binucleadas, lo que indica la inhibición de la citocinesis, aunque no podemos descartar un papel de PLK en la acumulación de células en G2. Entre los genes que se reprimieron por el SKF104976 y se incrementaron por el colesterol, destacó FABP5, cuya expresión se activaba por PPARγ. La inhibición de este gen mediante siRNA incrementó la expresión de genes diana de SREBP, LXR y PPARγ, lo cual refleja su importancia en el mantenimiento de la homesotasis lipídica en las células HL-60. Además, la estimulación de la diferenciación celular inhibía la expresión de FABP5. Por último, caracterizamos el promotor de DHCR24, cuya estructura era similar a la de otros genes dianas de SREBP. La regulación de este promotor está mediada fundamentalmente por colesterol, e identificamos un elemento regulado por esteroles (SER) funcional en -99/-90, próximos al cual se localizaron varios elementos para los cofactores Sp1, NF-Y y YY1. También encontramos secuencias de unión a EGR2 y KLF5, que podrían participar en la regulación de este gen. Por último, observamos una ligera activación de la expresión de este gen en respuesta al estrés oxidativo, que parecía estar mediada por SREBP-2.

Cholesterol is a key molecule in cell physiology, since it is a structural component of cell membranes, a precursor of steroid hormones and biliary acids and a regulator of different cellular processes. Moreover, our group has demonstrated that cholesterol is essential for cell cycle progression. The principal mechanism of regulation of cellular cholesterol content is the SREBP-regulated gene transcription. In the present work we aimed to study how changes in cholesterol availability alter gene expression and to identify new genes that respond to this lipid. For this, we used the CholestchipTM, a focused microarray for the study of genes involved in lipid metabolism and cell cycle. Firstly, we found that the best method for data normalization in our experimental conditions was LOWESS on calibrators. Then, we studied the effect of the treatment with the cholesterol synthesis inhibitor SKF104976 and that of the subsequent cholesterol addition, either complexed with methyl-β-cyclodextrin (Chol-BMCD) or provided with LDL, on gene expression in HL-60 cells. We found that such an inhibitor increased the expression of most of the genes of cholesterol synthesis, which are SREBP targets, and that this effect was rapidly reverted after the addition of Chol-BMCD. However, the effect of LDL was slower. The expression of some genes of fatty acid synthesis was also increased by SKF104976 and subsequently reduced by cholesterol addition. Moreover, SKF104976 repressed several cell cycle genes, such as SKP2, PLK and CDC20, whereas their expression recovered after cholesterol addition. These effects were consistent with the effects produced by these treatments on cell cycle progression. The inhibition of these cell cycle genes by cholesterol depletion was associated with the accumulation of tetraploid binucleated cells, indicating an inhibition of cytokinesis. However, an involvement of PLK in the accumulation of cells in G2 can not be ruled out. FABP5 was among the genes repressed by SKF104976 and stimulated by cholesterol. Moreover, FABP5 expression was found to be increased by troglitazone, a PPARγ agonist. On the other hand, siRNA-mediated inhibition of FABP5 in HL-60 cells resulted in increased expression of different genes which are targets of SREBP, LXR and PPARγ, thus reflecting the importance of FABP5 in lipid homoeostasis. Moreover, the stimulation of cell differentiation decreased FABP5 expression. Finally, we characterized the promoter of DHCR24, and found that its structure is similar to that of the promoter of other SREBP target genes. Cholesterol regulates the activity of the promoter of DHCR24, and, consistently, we identified a functional sterol regulatory element (SRE) at position -99/-90, in whose proximity we localized response elements for cofactors Sp1, NF-Y and YY1. In this promoter we also found binding sequences for EGR2 and KLF5, which may participate in the regulation of DHCR24 transcription. Finally, we observed that oxidative stress mildly increases DHCR24 expression, an effect which may be mediated by SREBP-2.