Análisis bioquímico de las proteínas de reparación del DNA Ku y Ligasa D de Bacillus subtilis
Author
Ory López, Ana deAdvisor
Vega José, Miguel deEntity
UAM. Departamento de Biología Molecular; Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBM)Date
2016-12-19Subjects
Bacillus subtilis - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 19-12-2016Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 19-06-2018
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
Bacillus subtilis en una bacteria Gram-positiva formadora de esporas provista del sistema de reparación
de roturas de las dos cadenas del DNA mediante la Unión de Extremos No Homólogos (NHEJ). Este
sistema está constituido por la proteína de unión a DNA Ku (BsuKu) que se une a las roturas y recluta a la
Ligasa D dependiente de ATP (BsuLigD) que posteriormente cataliza el relleno de los pequeños gaps que
pudieran surgir durante el alineamiento de los extremos y el sellado de los nicks resultantes, contribuyendo
a la estabilidad genómica durante la fase estacionaria y la germinación de las esporas.
Hasta el momento, las únicas funciones descritas para la proteína Ku procariota eran la unión a los
extremos del DNA procedentes de roturas y el reclutamiento de la LigD para su posterior procesamiento
y reparación. En esta Tesis Doctoral, se ha identificado la presencia de una actividad AP/5´-dRP liasa en
BsuKu, capaz de reconocer y procesar sitios abásicos (AP) tanto en ssDNA, dsDNAs con extremos 5´-protuberantes
y romos, así como en moléculas de DNA sin extremos. Esta nueva actividad de BsuKu, en coordinación
con las actividades de polimerización y ligasa de BsuLigD, hacen posible la unión eficiente de fragmentos
de DNA portadores de sitios AP próximos a extremos 5´-protuberantes. Además, hemos demostrado
la presencia de la actividad AP-liasa también en la proteína Ku de la bacteria Gram-negativa Pseudomonas
aeruginosa, hecho que nos permite expandir nuestros resultados a otras proteínas Ku bacterianas.
Por otra parte, hemos identificado la presencia de una actividad dRP-liasa localizada en el dominio
ligasa N-terminal de la proteína BsuLigD. Esta actividad, junto con las de polimerización y ligación, permite
la reparación eficiente de un DNA portador de un sitio AP en una reacción reconstituida in vitro de Reparación
por Escisión de Bases (BER). El requerimiento de los pasos de polimerización, eliminación del grupo
5´-dRP y ligación final, junto con el hecho de que BsuLigD y Nfo (la AP-endonucleasa de la espora), confieren
a las esporas resistencia a la desecación, sugiere que BsuLigD podría estar participando activamente
en una potencial vía BER en la espora. Hemos demostrado que la actividad dRP-liasa no es específica de
BsuLigD, sino que se encuentra también en la de P. aeruginosa, permitiéndonos extrapolar nuestras observaciones
al resto de LigDs bacterianas.
Asimismo, se ha determinado que BsuLigD tiene una actividad AP-liasa clásica en sustratos de
DNA con extremos 5´-recesivos. Esta actividad requiere la presencia de metal, así como la unión (aunque no
la incorporación) en el centro activo de polimerización del nucleótido correcto que habría de reemplazar el
sitio AP tras su eliminación, sugiriendo la necesidad de la formación de un complejo preternario estable para
que se lleve a cabo el procesamiento del sitio AP a la espera de la posterior reacción de ligación a un primer.
Por último, se ha mostrado la capacidad de BsuLigD de incorporar ribonucleótidos frente a lesiones
en el molde de moléculas de DNA, tales como 8-oxodG, timidin-glicol y 5-hidroxi desoxicitidina, y la posterior
ligación del producto elongado a un extremo 5´-P. Estos resultados podrían implicar a esta proteína
no solo en las rutas NHEJ y BER, sino también en la ruta de tolerancia al daño en el DNA conocida como
Síntesis a Través de Lesión. Bacillus subtilis is a Gram-positive sporulating bacterium endowed with a double-strand break Non-
Homologous End-Joining (NHEJ) repair system. This system is constituted by the DNA-binding protein Ku
(BsuKu) that binds to the broken ends and recruits the ATP-dependent DNA ligase D (BsuLigD) that further
catalyses both, filling of the short gaps that could arise after synapsis, and ligation of the resulting nicks,
contributing to genome stability during the stationary phase and the spore germination.
So far, the only described functions for the prokaryotic Ku were binding to the broken ends of DNA
and recruitment of LigD. In this Thesis, we have identified the presence of an AP/5´-dRP lyase activity in
BsuKu. This protein can recognize and process AP sites present in ssDNA, in both, 5´-protruding and blunt
ends, as well as in DNA molecules without ends. This newly identified activity in BsuKu, in coordination
with BsuLigD’s polymerization and ligation activities, makes possible the efficient joining of 5´-protruding
DNA ends with near terminal AP sites. We have shown that the homolog protein from the distantly related
Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa also exhibits this activity, a fact that allows us to infer
its general presence in the bacterial Ku proteins.
Additionally, we have identified the presence of a 5´-dRP-lyase activity located at the N-terminal
ligase domain of BsuLigD. This activity, along with its polymerization and ligation activities, allows efficient
repairing of AP-containing DNA in an in vitro reconstituted Base Excision Repair (BER) reaction.
The requirement of a polymerization, a 5´-dRP removal and a final sealing step in BER, together with the
joint participation of BsuLigD with the spore specific AP-endonuclease Nfo in conferring spore resistance
to desiccation, suggests that BsuLigD could actively participate in this pathway. We have demonstrated that
this 5´-dRP-lyase is also present in P. aeruginosa LigD, allowing us to expand our results to other bacterial
LigDs.
Likewise, we have determined that BsuLigD has a classical AP-lyase activity that acts on 5´-recessive
DNA ends. In this case the cleavage at the AP site requires the presence of metal ions, as well as the
binding of the correct nucleotide that would replace the AP site at the polymerization active site, a fact that
suggests the formation of a stable preternary complex required to process the AP site before the subsequent
ligation to an incoming primer strand.
Finally, it is shown the ability of BsuLigD to incorporate ribonucleotides opposite lesions in the
template strand, such as 8-oxodG, thymidine-glycol and 5-hydroxy deoxycytidine, ligating the extended
product to a 5´-P end. These results could involve BsuLigD not only in NHEJ and BER, but also in the DNA
damage tolerance pathway Translesion Synthesis.
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