Influence of GRK2 levels in hepatic pathophysiology

Abstract

G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) phosphorylates and desensitizes G protein coupled-receptors (GPCRs), and plays an important role in the development of both insulin resistance (IR) and obesity in vivo. In this work we further explore the role of GRK2 in these disorders, focusing on the establishment and progression of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), a disease spectrum related to obesity and IR. We find that hepatic GRK2 protein levels are upregulated in different mouse models of steatosis and, conversely, we demonstrate that the development of NAFLD is prevented in mice with low levels of GRK2 (GRK2+/- mice) upon a high fat diet (HFD). Moreover, using an inducible GRK2 knock-out mouse model we demonstrate that decreasing GRK2 levels during the course of the high-fat feeding reverts the HFD-induced obese and insulin-resistant phenotype. GRK2 downmodulation prevents further body weight gain and fat mass accretion, causes beneficial effects in glucose tolerance and insulin sensitivity and increases the expression of markers of thermogenesis in brown adipose tissue after the HFD. In the liver, tamoxifen-induced GRK2-/- mice are protected from NAFLD, showing less signs of lipid accumulation and inflammation compared to control littermates after the HFD. We also used a methionine and choline deficient diet (MCD) as a model of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) that is independent of fat mass accretion and IR. A blinded anatomopathological analysis revealed that GRK2+/- mice are protected from the development of NASH detected in their WT littermates. GRK2+/- mice show decreased hepatic triglyceride accumulation, inflammation and ER stress responses, while they preserve protective mechanisms against MCD-induced NASH that are lost in WT mice, as indicated by markers of autophagy or mitochondrial biogenesis and fusion. Interestingly, GRK2 protein and mRNA levels are upregulated in human liver biopsies from simple steatosis and NASH patients when compared to normal liver samples. Moreover, GRK2 overexpression is per se able to increase palmitic acid-induced steatosis in human hepatoma cells, thus establishing not only a parallelism but rather a cause-effect relationship between the expression levels of this kinase and lipid accumulation. Conversely, fasting, which induces a state of physiological hepatic steatosis, provokes a similar degree of lipid deposition in livers of WT and GRK2+/- mice, together with a marked decrease in hepatic GRK2 levels in both genotypes. However, GRK2+/- mice display higher levels of fasting serum fatty acids and glucose. Remarkably, glucagon-induced glucose production and mRNA expression of the gluconeogenic enzyme PEPCK are enhanced in mouse primary hepatocytes with silenced GRK2 demonstrating that this kinase can regulate glucagon actions in these cells. In sum, our results suggest that GRK2 acts as a central integrative node able to regulate different intracellular routes that control metabolic responses in vivo due to its unique ability to both directly modulate the insulin receptor cascade as well as key GPCRs related to metabolism (such as the glucagon receptor). These results consolidate GRK2 as a prospective therapeutic target for a potential clinical intervention in diseases with a metabolic component such as IR, obesity and NAFLD.

La proteína GRK2 es una quinasa clásicamente conocida por su función en la desensibilización de receptores acoplados a proteínas G (GPCR). Sin embargo, se ha descrito que GRK2 desempeña un papel importante en el desarrollo de resistencia a la insulina (IR) y obesidad in vivo. En este trabajo, se analiza el papel de GRK2 en estas situaciones patológicas centrándonos específicamente en la enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD), una condición estrechamente relacionada con obesidad e IR. Así, encontramos que los niveles proteicos de GRK2 se incrementan en el hígado en diferentes modelos murinos de esta patología y demostramos que los ratones con niveles reducidos de GRK2 (animales GRK2 +/-) están protegidos frente al desarrollo de NAFLD inducida por una dieta alta en grasa (HFD). Además, mostramos que una reducción genética inducible en los niveles de GRK2 no sólo previene sino que revierte el desarrollo de obesidad, IR y NAFLD. Los ratones Tam-GRK2-/- (inducidos por tamoxifeno) en los que se reducen los niveles de la quinasa cuando los animales ya han desarrollado un fenotipo obeso y resistente a la insulina por la dieta dejan de ganar peso a pesar de continuar con la HFD, tienen menor acumulación de grasa y una mayor expresión de marcadores de termogénesis en el tejido adiposo marrón. Además, estos animales Tam-GRK2-/- no desarrollan NAFLD tras la HFD mostrando una menor acumulación de lípidos y menos marcadores de inflamación en el hígado en comparación con animales control. Por otro lado, se utilizó una dieta deficiente en metionina y colina (MCD) como modelo de esteatohepatitis no alcohólica (NASH) independiente de obesidad e IR. Un análisis anatomopatológico ciego reveló que los ratones GRK2+/- están protegidos frente al desarrollo de NASH, al contrario que los animales silvestres (WT) que sí desarrollan esta patología tras la MCD. En ratones GRK2+/-, la MCD causa menor acumulación de triglicéridos, inflamación y estrés de retículo en el hígado comparado con animales WT. Además, estos animales GRK2 +/- conservan mecanismos de protección frente a NASH que se pierden en ratones WT, como indican los marcadores de autofagia o de biogénesis y fusión mitocondrial. Los niveles de proteína y mRNA de GRK2 se encuentran aumentados en biopsias hepáticas de pacientes diagnosticados con esteatosis simple o NASH en comparación con individuos con histología hepática normal. Además, la sobreexpresión de GRK2 en una línea de células hepáticas humanas provoca per se una mayor esteatosis inducida por ácido palmítico estableciendo así no sólo un paralelismo sino una relación causa-efecto entre los niveles de GRK2 y la acumulación de lípidos intracelulares en hepatocitos. El ayuno, que induce un estado de esteatosis hepática fisiológica, provoca la acumulación de grasa en hígado además de una importante reducción en los niveles de GRK2 en la misma medida en ratones WT y GRK2+/-. Los ratones GRK2 +/- tienen niveles más altos de ácidos grasos libres circulantes así como de glucosa en ayunas. El silenciamiento de GRK2 en hepatocitos primarios de ratón provoca una mayor producción de glucosa a partir de piruvato y un aumento en la expresión de la enzima gluconeogénica PEPCK inducidas por glucagón, lo que demuestra que GRK2 puede regular las acciones del glucagón. Nuestros resultados identifican a GRK2 como un nodo señalizador al ser capaz de regular tanto la cascada de la insulina como GPCRs importantes para el control del metabolismo como el receptor de glucagón. Nuestros resultados consolidan esta quinasa como una posible diana terapéutica para una posible intervención clínica en enfermedades con un componente metabólico como IR, obesidad y NAFLD.