Identificación y caracterización de mutaciones de splicing en pacientes con hiperfenilalaninemia; aproximaciones terapéuticas específicas de RNA

Abstract

En este trabajo nos hemos centrado en el estudio de mutaciones de splicing que resultan en hiperfenilalaninemia (HFA), bien por defectos en la enzima 6-piruvoil-tetrahidropterina sintasa (PTPS) que causa la deficiencia de tetrahidrobiopterina (BH4), cofactor de las hidroxilasas de aminoácidos aromáticos, o bien por defectos en una de dichas hidroxilasas, la fenilalanina hidroxilasa (PAH). Por una parte, hemos estudiado dos nuevas variantes, c.164-672C>T y c.243+3A>G en el gen PTS identificadas en un paciente HFA debido a un defecto en la enzima PTPS. La variante intrónica profunda c.164-672C>T crea un potencial sitio 5’ de splicing que, según los análisis en fibroblastos del paciente y en minigenes, conduce a la inclusión de varios pseudoexones entre los exones 2 y 3 del mRNA del gen PTS. Este efecto pudo ser parcialmente revertido mediante oligonucleótidos antisentido (AONs) de diferente química. La variante c.243+3A>G afecta al sitio natural 5’ de splicing del exón 4 resultando en el skipping del mismo. La sobreexpresión de un U1 snRNA adaptado, perfectamente complementario al sitio 5’ de splicing mutante, permitió recuperar el transcrito normal en el sistema de minigenes, no así en fibroblastos, siendo necesario la optimización futura de esta estrategia. Con el propósito de mejorar la aplicación de la terapia antisentido se ha estudiado un nuevo método de vehiculización de AONs, los micro-minicírculos (miMCs), vectores plasmídicos compuestos solamente por secuencias eucariotas. Para testar la eficacia de los miMCs se utilizó un plásmido parental que expresaba la fusión U7 snRNA-AON dirigido al sitio natural 5’ de splicing del exón 11 del gen PAH con el fin de forzar la exclusión de dicho exón. Los resultados obtenidos tras la producción de los miMCs y la posterior transfección en una línea de hepatoma revelaron una baja eficiencia de los miMCs como vehículo para la terapia con AONs en nuestro modelo experimental, ya que sólo se observó un skipping parcial del exón 11. Por otra parte, el uso de la secuenciación masiva para la captura completa del gen PAH en 7 pacientes con HFA en los que solo se les había encontrado una mutación PAH nos permitió identificar variantes intrónicas profundas. La interpretación de las variantes mediante un sistema de priorización y el uso de herramientas bioinformáticas nos ha permitido seleccionar aquellas variantes intrónicas con un posible efecto sobre el mecanismo de splicing mediante la potencial inclusión de pseudoexones. Sin embargo, el análisis funcional mediante minigenes descartó dicho efecto indicando que las variantes seleccionadas no son causantes de enfermedad. Finalmente, se ha investigado el efecto patogénico de las variantes c.1199+17G>A y c.1199+20G>C, identificadas en el gen PAH en pacientes con HFA. Ambas mutaciones provocan la exclusión del exón 11 en un sistema de minigenes e impiden la unión de U1 snRNP70 a esta región según los ensayos de unión a RNA. El análisis de los minigenes con deleciones y mutaciones puntuales en esta región, junto con la sobreexpresión de U1 snRNAs adaptados nos ha permitido identificar los motivos críticos involucrados en la regulación del correcto splicing del exón 11. Los resultados indicaron que la unión de U1 snRNP corriente abajo del sitio natural 5’ de splicing determina el splicing eficiente del exón 11, proporcionando así una base para el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas a corregir mutaciones de splicing que afecten al exón 11 del gen PAH y ampliando las funciones de U1 snRNP como potenciador de splicing en ciertos contextos.