Bases estructurales y moleculares de la proliferación viral. Mecanismo de replicación y transcripción en gripe A
Author
Carlero Carnero, DiegoAdvisor
Martín-Benito Romero, JaimeEntity
UAM. Departamento de Biología Molecular; CSIC. Centro Nacional de Biotecnología (CNB)Date
2021-11-19Subjects
Gripe A; ARN polimerasas; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 19-11-2021Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 19-05-2023
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Abstract
El genoma del virus de la gripe consiste en 8 segmentos de RNA de cadena sencilla y polaridad negativa encapsidados en complejos ribonucleoproteicos (vRNPs) compuestos por múltiples copias de una nucleoproteína y la polimerasa viral, un heterotrímero formado por las unidades PA, PB1 y PB2. Estas vRNPs son las encargadas de transcribir y replicar el genoma viral en el interior del núcleo de las células infectadas, procesos sobre los que aún no se conoce su mecanismo ni como están regulados. La transcripción se inicia a través de la unión de la polimerasa viral a un pre-mRNA del hospedador por la interacción de la estructura cap con la subunidad PB2. Este pre-mRNA es cortado 10 o 13 nucleótidos secuencia abajo, gracias a la actividad endonucleasa de PA, y ese fragmento es usado como cebador para comenzar el proceso de copiado del RNA viral o elongación. Tras la elongación, la transcripción termina con la generación de un poli-A dando lugar a un mRNAs completo. Por otra parte, el proceso de replicación de las RNPs se realiza en dos pasos y, contrariamente a la transcripción, en ambos pasos la iniciación de la síntesis del RNA es de novo, es decir, sin la necesidad de cebador. En el primer paso se procede a la formación de una RNP complementaria de polaridad positiva (o cRNP), que sirve de intermediario para la generación de nuevas RNPs virales (o vRNPs) a través de un segundo paso de replicación.
En esta tesis a través del sistema de expresión de proteínas basa en baculovirus se han generado, purificado y caracterizando funcional y estructuralmente polimerasas de la gripe A/NT/60/1968 a resoluciones de entre 3 y 6 Å mediante el uso de criomicroscopía electrónica (Crio-EM) unida al promotor c y v o libre de RNA. Los datos han mostrado que las polimerasas virales en unión a cualquiera de los dos promotores se encuentran en forma monomérica, mientras que aquellas que carecen de RNA están en forma dimérica, formando parte de su superficie de contacto el dominio C-terminal de PA, el pulgar de PB1 y el subdominio N1 de PB2. Además, comparando las distintas estructuras obtenidas, se aprecia una notable diferencia entre aquellas unidas al promotor v con las otras dos estructuras estudiadas, presentado un ordenamiento totalmente distinto del dominio endonucleasa de PA. Este estudio demuestra la gran flexibilidad que presenta la polimerasa del virus de la gripe A, proponiendo este factor como uno de los mecanismos clave en la regulación de la replicación y la transcripción del genoma.
A parte de su regulación, la transcripción y la replicación son procesos reiterativos en los que una misma RNP debe ser capaz de realizar múltiples copias de su RNA de manera continua. A pesar de la importancia de este hecho, la información sobre este mecanismo es escasa y por ello en esta tesis se propone un modelo de síntesis de RNA realizado por la polimerasa residente en las RNPs y que es común a ambos procesos. Este mecanismo, que hemos llamado “la cadena helicoidal procesiva” está basado en la extrema flexibilidad de la parte helicoidal de las RNPs, lo que permite un movimiento de deslizamiento entre las cadenas antiparalelas de nucleoproteína-RNA, posibilitando de esta manera a la polimerasa acceder a todo el genoma sin destruir la estructura cuaternaria de la RNP. Además, utilizando un sistema de generación y purificación de RNPs recombinantes fruto de replicación in vivo, junto con las polimerasas libres de RNA previamente descritas, se han conseguido poner a punto un ensayo de replicación in vitro que demuestran que el complejo replicativo funcional del virus de la gripe está formado por la polimerasa residente en la RNP y una única polimerasa externa, siendo esto totalmente compatible con el modelo de “la cadena helicoidal procesiva”
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