Desarrollo de terapias específicas de mutación en enfermedades metabólicas hereditarias
Author
Yuste Checa, PatriciaAdvisor
Pérez González, María BelénEntity
UAM. Departamento de Biología MolecularDate
2015-03-06Subjects
Enefermedades hereditarias metabólicdas - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 06-03-2015Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
La caracterización funcional específica de mutaciones causantes de enfermedad guía el
desarrollo de estrategias terapéuticas. En este trabajo hemos analizado funcionalmente mutaciones
que afectan al proceso de splicing y mutaciones missense con el fin de desarrollar terapias específicas
dirigidas a rescatar transcritos aberrantes y mutaciones desestabilizadoras.
En primer lugar, mediante el análisis del perfil transcripcional de células derivadas de
pacientes hemos caracterizado una mutación exónica y otra intrónica interna que afectan ambas al
proceso de splicing. La mutación exónica (c.75C>T), detectada en el gen ALDH7A1, genera un nuevo
sitio donador de splicing provocando la deleción de 35pb del exón 1 causando epilepsia dependiente
de piridoxina (PDE). La mutación intrónica interna (c.792+182G>A), identificada en el gen TMEM165
activa la inserción de un pseudoexón de 117pb procedentes del intrón 4 causando el defecto
congénito de glicosilación TMEM165-CDG. El efecto de estas dos mutaciones sobre el proceso de
splicing ha sido confirmado mediante el uso de un sistema ex vivo de minigenes. Por otra parte, con el
fin de caracterizar funcionalmente mutaciones missense identificadas en pacientes con CDG causado
por deficiencia de la enzima PMM2 (PMM2-CDG), hemos estudiado el perfil de oligomerización, la
actividad y la estabilidad de estos mutantes en un sistema de expresión procariota. Los resultados
in vitro combinados con análisis in silico mediante el algoritmo computacional FoldX y la localización
de los residuos en un modelo estructural de la proteína PMM2, nos ha permitido la clasificación de
los nueve mutantes estudiados en tres categorías: mutaciones que afectan al plegamiento (p.V44A,
p.D65Y, p.R162W, p.T237M, p.F207S y p.C241S), que retienen cierta actividad residual, mutaciones
que afectan al plegamiento y a las propiedades catalíticas de la proteína (p.R123Q y p.R141H), las
cuales tienen actividad nula, y una mutación que afecta a la dimerización de PMM2 (p.P113L).
Además, ha sido posible la recuperación de la actividad de algunos de los mutantes inestables en un
modelo celular de enfermedad en condiciones permisivas de plegamiento. Todos estos resultados
sugieren que la pérdida de función de la mayoría de los mutantes estudiados está basada en su
inestabilidad y por lo tanto en su tendencia a agregar o a ser degradados, mecanismo subyacente en
las denominadas enfermedades conformacionales.
Basándonos en estos resultados, el siguiente paso ha sido la búsqueda de terapias dirigidas
a rescatar los defectos de splicing y los mutantes inestables caracterizados previamente. Respecto
a las mutaciones de splicing, hemos conseguido una recuperación del perfil transcripcional y de
la proteína correctamente localizada de manera secuencia y dosis específica, tras el tratamiento
con oligonucleótidos antisentido que modulan el splicing de células de pacientes PDE y TMEM165-
CDG portadoras de las mutaciones c.75C>T y c.792+182G>A respectivamente. El éxito de la terapia
antisentido aplicada sobre una mutación exónica, constituye una prueba de concepto que amplía
su posible uso más allá de mutaciones intrónicas internas. Respecto a la terapia de recuperación de
mutantes inestables, el rastreo de una librería comercial de compuestos nos ha permitido identificar
quince potenciales chaperonas farmacológicas (PCs) que estabilizan la proteína PMM2. Estos
compuestos han sido evaluados posteriormente en un sistema de expresión procariota y algunos de
ellos han sido capaces de aumentar significativamente la actividad de la proteína WT y la estabilidad,
tanto de la PMM2 WT como de los mutantes de plegamiento. Además, cuatro compuestos han
conseguido rescatar la actividad de dos mutantes inestables, p.R162W y p.T237M, en un modelo
celular de enfermedad. Al mismo tiempo, hemos identificado un regulador de la proteostasis (PR),
celastrol, que también ha sido capaz de incrementar la actividad de mutantes inestables de PMM2
en el mismo modelo celular. Así, el celastrol podría ser aplicado conjuntamente con PCs con el fin
de aumentar de manera sinérgica la estabilidad de los mutantes y por tanto su actividad. Estos
resultados constituyen una prueba de concepto sobre el posible uso de fármacos estabilizadores
que recuperen la actividad de PMM2 y establece las bases para el desarrollo de una nueva terapia
para PMM2-CDG, el CDG más común y actualmente sin tratamiento.
En resumen, el éxito de las aproximaciones terapéuticas descrito en este trabajo para PDE,
TMEM165-CDG y PMM2-CDG, abre nuevas perspectivas para el tratamiento de enfermedades raras
al demostrar la eficacia de terapias basadas en el mecanismo de acción de las mutaciones. Functional characterization of disease causing mutations guides the development of tailored
therapeutic strategies. In this work we have analyzed functionally mutations affecting the splicing
process and also missense mutations to address the development of mutation specific therapies
aimed to rescue aberrant mRNA transcripts or unstable mutant proteins.
Firstly, we have characterized one exonic and one deep intronic mutation, both affecting
the splicing process, by analyzing the transcriptional profile of patients-derived cells. The exonic
mutation (c.75C>T), detected in ALDH7A1, generates a new exonic donor splice site generating an
aberrant transcript bearing a deletion of 35 nucleotides causing piridoxine-dependent epilepsy
(PDE). The deep intronic mutation (c.792+182G>A), identified in TMEM165 activates an intronic
pseudoexon insertion of 117 nucleotides causing a congenital disorder of glycosylation (TMEM165-
CDG). The effect of these two mutations on the splicing process has also been confirmed using an ex
vivo minigene system. Secondly, in order to characterize functionally missense mutations identified
in CDG due to PMM2 deficiency (PMM2-CDG), we have studied mutants´ oligomerization profile,
PMM2 activity and stability in a prokaryotic expression system. The in vitro results combined with
the in silico analysis by the FoldX algorithm and the residue location in a PMM2 protein structure
model allowed us to classify the nine studied mutants into three categories: destabilizing mutations
(p.V44A, p.D65Y, p.R162W, p.T237M, p.F207S and p.C241S) which retain some residual activity,
mutations affecting both folding and catalytic properties of the protein (p.R123Q and p.R141H)
which retain null residual activity, and one mutation affecting PMM2 dimerization (p.P113L).
Additionally, we have rescued PMM2 residual activity in a disease cellular model using permissive
folding conditions. These results suggest that the loss-of-function of most of these mutant proteins
is based on increased susceptibility to degradation and/or aggregation, a common mechanism
underlying conformational diseases.
Based on these results we have sought specific therapies to rescue splicing defects and
unstable mutant proteins. Regarding the splicing mutations, we have been able to recover in dose
and sequence specific manner the correct transcriptional profile and the proper proteins´ location by
applying splice-switching oligonucleotides to PDE and TMEM165-CDG patient derived cells carrying
c.75C>T and c.792+182G>A mutations respectively. The success of the exonic mutation therapy
is a proof-of-concept which broadens the application of antisense therapy beyond deep intronic
mutations. With respect to the therapy to recover the activity of unstable mutant proteins, a highthroughput
screening of a commercial compounds library has allowed us to find fifteen potential
pharmacological chaperones (PCs) for PMM2. These hits have been subsequently evaluated in
a prokaryotic system and some of them have increased significantly WT PMM2 activity and also
WT and mutants´ stability. Furthermore, four of them have rescued PMM2 activity in a cellular
disease model carrying either the destabilizing mutation p.R162W or p.T237M. In addition, we have
identified a proteostasis regulator (PR), celastrol, which has also increased mutants´ activity in the
same eukaryotic system. The PR could be co-applied with PCs in order to increase mutants´ stability
and subsequently residual activity in a synergistic manner. These results are a proof-of-concept of the
PMM2-CDG treatment by small stabilizer molecules and pave the way to develop a new promising
therapy for PMM2-CDG, the most common CDG for which, up to date, there is no curative treatment
available.
In conclusion, the success of the therapeutic approaches on PDE, TMEM165-CDG and PMM2-
CDG described in this work shed some light on novel treatments for other rare diseases by specific
mutation therapies aimed at mRNA or protein targets.
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