Análisis de dominios funcionales del transportador ABC de "Saccharomyces cerevisiae", Ycf1p, mediante mutagénesis dirigida y supresión intragénica
Author
Falcón Pérez, Juan ManuelAdvisor
Eraso Mazmela, PilarEntity
UAM. Departamento de BioquímicaDate
1999-11-30Subjects
Saccharomyces cerevisiae-Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita de la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 30-11-1999Abstract
La proteína vacuolar Ycflp (Yeast Cadmium Factor) está implicada en la
resistencia a CdZ+y a otras sustancias tóxicas que son conjugadas con glutation en
Saccharoinyces cerevisiae. Pertenece a la familia de transportadores ABC (ATP
Binding Cassette) que incluye proteínas humanas como CFTR (Cystic Fibrosis
Conductance Transmembrane Regulator) y MRPl (Multidrug Resistance-associated
Protein).
El objetivo de este trabajo ha sido profundizar en el estudio de las relaciones
estructurales y funcionales de la proteína Ycflp.
En una primera aproximación se crearon mediante mutagénesis dirigida
veintidós mutaciones únicas en residuos conservados de los dominios de unión a
nucleótido (NBDl y NBD2), transmembrana (TMD2) y regulador (R) de la proteína.
La caracterización de los mutantes ha llevado a la identificación de residuos
esenciales para la biogénesis (Ile711, Leu7lZP, he713,G I u~'y~ G ly1413),p ara la función
(Gly663G, ly756A, sp777,G ly1306Y Gly1311) Y para la regulación (IleS4', TyrsS, Alagi0 y
Arg1143)d e Ycflp. Una segunda aproximación ha consistido en el análisis de
supresión intragénica de cinco mutaciones localizadas en los dominíos NBDl
(G663V, G756D y D777N) o NBD2 (G1306E y G1311R) e implicadas en la unión y/o
hidrólisís de ATP. Todos los revertientes de los mutantes G663V, G756D, G1306E y
G1311R resultaron ser reversiones de la mutación primaria a la secuencia silvestre.
En cambio se han aislado trece mutaciones supresoras de la mutación D777N
localizadas en los dominios: TMDl (V543I y F565L), TMD2 (A1003V, A1021T,
A1021V, N1027D, Q1107R, G1207ü, G1207ü, S1212L y W1225C), NBDl (S674L) y
NBD2 (R1415G). Esta localización demuestra la-íteracción física y/o funcional de
NBDl con los otros tres dominios. La caracterización de los mutantes supresores
indica que el mecanismo de supresión implica una alteración en la especificidad de
sust.rato. The yeast cadmium factor (Ycflp) is a vacuolar protein involved in
resistance to Cd2+ and to exogenous glutathione S-conjugate precursors in yeast. It
belongs' to the superfamily of ATP binding cassette transporters, which includes
the human cystic transmembrane conductance regulator (CFTR) and the
multidrug resistance-associated protein (MRP1).
The prímary objective of the present study has been to analyze in depth the
structural and functional relationships of Ycflp protein.
In a first approach twenty-two single mutations were generated by sitedirected
mutagenesis in conserved residues located in the nucleotide binding
(NBD1 and NBD2), transmembrane (TMD2) and regulatory (R) domains of the
protein. Mutants characterization has identified essential residues for Ycflp
biogenesis (Ile711, Leu71: Phe713, G ~ Y u ~ ~func~tion (Gly663,G lyn6, Aspm,
GlyI3O6 y Gly1311) and regulation (Ilea4', Tyrs", Alag1' and Arg1143). In a second
approach we have performed an intragenic suppressor analysis of five inactive
mutations located in NBDl (G663V, G756D y D777N) or NBD2 (G1306E y G1311R)
and involved in ATP bindíng and/or hydrolysis. Revertants from G663V, G756D,
G1306E y G1311R mutants corresponded to full revertants of the initial mutation.
Thirteen second-site suppressor mutations have been isolated for D777N
mutation. Suppressor mutations are located ín the domains: TMDl (V543I y
F565L), TMD2 (A1003V, A1021T, AlOZlV, N1027D, Q1107R, G1207D, G1207S,
S1212L and W1225C), NBDl (S674L) and NBD2 (R1415G). These results
demonstrate the interaction, direct or indirect, between NBDl and the other three
domains. Characteriiation of the suppressor mutants shows that changes in
substrate specificity of the protein are involved in the suppression mechanism.
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