Funciones y mecanismo de acción del factor de crecimiento tipo insulina-i (IGF-I) durante el desarrollo temprano del oído interno
Autor (es)
Sanz Miguel, María del CarmenEntidad
UAM. Departamento de BioquímicaFecha de edición
1999-01-19Materias
Factores de crecimiento - Tesis doctorales; Oído interno - Crecimiento - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNota
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 19-01-1999Resumen
La función del factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF-1), se investigó durante el desarrollo temprano del oído interno. La expresión del IGF-1 y del receptor de tipo 1 en la vesícula ótica (OV) y el ganglio cocleovestibular (CVG) se estudió por hibridación in situ . Ambos se expresan homogéneamente en el epitelio ótico y en el CVG. EL IFG-I estimuló el crecimiento de la OV y del CVG cultivados in vitro. En cultivos de OVs, el IGF-1 indujo la síntesis de ADN, incrementó el número de células y de mitosis de forma dependiente de la dosis. Las OVs incubadas con el IGF-1 se desarrollaron desde el estadio 18 hasta el 21 en 24 horas, remedando en patrón mitótico y morfogenético que ocurre in vivo.
El mecanismo de señalización intracelular del IGF-1 se estudió analizando la hidrólisis de glicosil-fosfatidilinositol, la activación de la vía Raf/MAPK y la expresión de las oncoproteínas Fos y Jun.
El IGF-1 produjo la hidrólisis de un glicosil-fosfatidilinositol de membrana, el precursor del inositol fosfoglicano (IPG). Los anticuerpos dirigidos contra el IPG, bloquearon el efecto del IGF-1. El IPG indujo la expresión de marcadores de proliferación celular que están asociados con las acciones del IGF-1 en la OV (PCNA, Fos y Jun) y un anticuerpo anti-IPG bloqueó eficientemente la inducción de estos genes. Estos resultados indican que la liberación de IPG era esencial para la respuesta proliferativa del IGF-1.
Se investigó el patrón de expresión de la quinasa c-Raf, así como la consecuencia de la manipulación de los niveles de c-Raf mediante la sobreexpresión de vectores virales c-raf en cultivos organotípicos de OVs. Durante los días embrionarios 2 y 3 (E2 y E3), la expresión de c-Raf en la OV permaneció constante. La actividad de c-Raf se incrementó en respuesta a IGF-1 y esta activación era imprescindible para la proliferación celular de la OV. La sobreexpresión de c-Raf en explantes E2.5 potenció la respuesta proliferativa al suero y al IGF-1 y bloqueó la diferenciación inducida por el ácido retinoico. El incremento en los niveles de c-Raf también previno la muerte celular programada inducida por el NGF. Por tanto, el control estricto de los niveles c-Raf es esencial para la coordinación de los procesos biológicos que ocurren simultáneamente durante el desarrollo temprano del oído interno.
Se estudiaron las proteínas Fos y Jun durante el desarrollo del oído interno. Los protooncogenes c-jim y c-fos se expresaban en la vesícula ótica. Esta expresión coincide con los estadios de máxima proliferación. La expresión de c-Fos y Jun se indujo por el IGF-1 y fue un requisito para la proliferación de la OV. La expresión de c-jun se analizó por hibridación in situ de embriones de estadio 14 al 20 y se localizaba en la región dorsal de la copa y vesícula ótica. En este trabajo se analiza el patrón de muerte celular programada en el oído interno de pollo desde los estadios 14 al 20. La expresión de c-jun colocalizó con la zona dorsal de apoptosis. Además. en estas zonas existía fosforilación de c-Jun en la serina 63. Estos resultados indicaban que la fosforilación de cJun por las JNKs (quinasas que fosfonlan el extremo N-terminal de c-Jun) ocurre durante la apoptosis en el oído interno. The role of insulin-like growth factor type 1 (IGF-1) was investigated during the early development of the inner ear. The occurrence of IGF-1 and its type 1 receptor in the otic vesicle (OV) and cochleo-vestibular ganglion (CVG) was explored by in situ hybridisation. The expression in the epithelium of the otic vesicle and in the CVC appeared homogeneously distributed. In cultures of OVs, IGF-1 induced DNA synthesis, increased cell number and mitotic rate in a dose-dependent manner. In the presence of IGF-1, cultured otic vesicles developed from stage 18 to stage 21 in 24 hours, mimicking the normal mitotic pattern and morphogenesis in vivo.
The intracellular signaling mechanisms of IGF-1 were explored by studying the turnover of membrane glycosyl-phosphatidylinositols, the activation of Raf/MAPK pathway and the expression of Fos and Jun oncoproteins.
IGF-1 promoted the hydrolysis of a membrane glycosyl-phosphatidylinositol, the precursor of inositol phosphoglycan (IPG). Antibodies raised against IPG blocked the effects of IGF-1. IPG induced the expression of molecular markers of cell proliferation associated with the action of IGF-1 in the OV (PCNA, Fos and Jun). In addition, anti-IPG antibodies effectively blocked the induction of these genes. These results indicate that the release of IPG is an essential requirement for the growth response elicited by IGF-1.
We have investigated the pattern of expression of c-Raf kinase and the consequences of manipulating c-Raf levels by misexpression of c-raf in organotypic cultures of otic vesicles. The OVs expressed c-Raf and its levels remained constant during embryonic days 2 and 3 (E2-E3). c-Raf activity was increased in response to IGF-1 and this activation was a requirement to initiation of cell proliferation in the OV. Overexpression of c-raf in E2.5 explants increased the proliferative response to low serum and IGF-1 and blocked differentiation induced by retinoic acid. The increase in c-Raf levels also prevented nerve growth factor (NGF)-dependent induction of programmed cell death. Hence, a strict control of c-Raflevels is essential for the co-ordination of the biological processes that operate simultaneously during early inner development.
The role of c-Jun and Fos proteins during the early development of the inner ear was investigated. c-jun and c-fos proto-oncogenes were found to be expressed in the otic vesicle. Their endogenous expression coincides with stages of high proliferative activity. The expression of c-Fos and Jun were induced by IGF-1 and were required for OV proliferation. Whole mount in situ hybridisation analyses of c-jun expression performed from stages 14 to 20, indicated that c-jun transcripts were expressed in the otic pit and OV as well as in the CVG with dorsal expression. In this work we describe the pattern of programmed cell death in the chicken inner ear from stages 14 to 20. The expression of c-jun co-located with the dorsal area of apoptosis. Furthermore, phosphorylation of c-Jun at serine-63 residue occured within the same area in the stages studied. These results indicate that cJun phosphorylation by Jun N-terminal Kinases takes place during apoptosis in the inner ear.
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