Molecular causes and mechanisms of genomic instability in G1- deregulated cell cycle
Author
Gomes, Fabia AraujoAdvisor
Calzada García, José ArturoEntity
UAM. Departamento de Biología Molecular; CSIC. Centro Nacional de Biotecnología (CNB)Date
2016-06-02Subjects
Ciclo celular - Tesis doctorales; Células - División - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 02-06-2016Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 02-06-2018
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
Eukaryotic DNA replication initiates at numerous sites called origins and is tightly
regulated so that chromosomes are accurately replicated only once per cell cycle.
Absence of active cyclin-dependent kinase (CDK) complexes from late mitosis and
during G1 allows the licensing of origins for their potential activation later in S phase. At
the G1/S transition, rising levels of CDK activity block additional origin licensing and
promote the activation of a subset of licensed origins, together with Dbf4-dependent
kinase (DDK) activity. Origin activation follows a spatiotemporal program during S
phase that is highly conserved in cell populations but partially stochastic in individual
cells, and presumed to largely influence the timely completion of DNA replication due
to exceeding numbers of licensed origins available to counteract hindered forks.
Replication completion is critical to the genome integrity, as cells allowed to enter
mitosis with on-going forks might suffer from chromosome breaks upon premature
segregation during anaphase.
In both yeast and mammals, genomic instability arises when the G1/S transition
is deregulated, as cells escaping this control have proliferative advantages and a
mutator phenotype. Indeed, cancer cells often show mutations in G1/S regulators and
perturbed DNA replication; furthermore, genomic instability is a hallmark of cancer.
However, the molecular mechanism by which G1-phase deregulation causes genomic
instability remains poorly understood. To study this question, we used budding yeast
cells lacking the CDK inhibitor Sic1, a central regulator of the G1 phase and
orthologous to p27Kip1 in mammals, as eukaryotic model of oncogenic cell cycles. Here
we show that in the absence of Sic1, cells loose functional origin redundancy that
directly causes chromosomal instability. Moreover, we report that the differential loss of
origin redundancy along the genome delays the completion of DNA synthesis at
specific chromosomal regions. Importantly, these defects at sites containing elements
delaying fork-progression commit chromosomes to fragility. Finally, we show that
chromosomal instability in cells lacking Sic1 can be supressed by retaining cells prior
to anaphase entry without alleviating G1-phenotype and origin activity defects,
consistent with uncoupled DNA replication completion and mitosis entry. We conclude
that in G1/S deregulated cells, chromosomal regions with an irregular distribution of
inefficient origins are delayed in completing replication by lacking of functional origin
redundancy that causes genomic instability. Moreover, additional obstacles to fork
elongation at these regions may impede DNA replication completion and commit these
sites to fragility by resulting in chromosome breaks during mitosis, which is considered
a driving force of oncogenesis. La replicación del DNA eucariota se inicia en numerosos sitios llamados
orígenes y se regula para que los cromosomas se repliquen una única vez por ciclo
celular. La ausencia de complejos quinasa dependientes de ciclina (CDK) activos
desde el final de mitosis y durante la fase G1 permite el licenciamiento de los
orígenes, para su potencial disparo en fase S. El aumento de los niveles de actividad
CDK en la transición G1/S bloquea nuevos licenciamientos y promueve el disparo de
una parte de los orígenes licenciados, juntamente con la actividad de la quinasa
dependiente de Dbf4 (DDK). La activación de orígenes en fase S sigue un programa
espacio-temporal, muy conservado en poblaciones celulares pero estocástico en
células individuales, que presumiblemente permite la finalización a tiempo de la
replicación gracias al exceso de orígenes licenciados disponibles para rescatar
horquillas paradas. Completar la replicación es crítico para la integridad del genoma,
ya que células entrando en mitosis con horquillas activas podrían sufrir rupturas
cromosómicas durante una segregación prematura en anafase.
En levaduras y en mamíferos hay inestabilidad genómica cuando se desregula la
transición G1/S, porque estas células tienen ventajas proliferativas y un fenotipo
mutador. De hecho, las células cancerosas tienen alteraciones frecuentes de los
reguladores de G1/S y muestran una replicación aberrante del DNA; además, la
inestabilidad genómica es una propiedad del cáncer. Sin embargo, el mecanismo
molecular por el que un G1 desregulado causa inestabilidad es poco conocido. Para
estudiarlo, hemos utilizado levaduras carentes del inhibidor de CDK Sic1, un regulador
central de G1 y ortólogo de p27Kip1 en células de mamífero, como modelo eucariota de
ciclos celulares oncogénicos. Mostramos que en ausencia de Sic1 la pérdida de
redundancia de orígenes causa directamente inestabilidad cromosómica. Además,
mostramos que la pérdida diferencial de redundancia de orígenes en el genoma
retrasa la finalización de la replicación en regiones cromosómicas específicas.
Importantemente, este defecto convierte estas zonas en frágiles frente a elementos
que retrasan la replicación. Finalmente, mostramos que la inestabilidad cromosómica
en estas células se suprime retrasando la entrada en mitosis, consistente con un
desacoplamiento entre finalización de la síntesis del DNA y la entrada en mitosis.
Concluimos que en células desreguladas en G1/S, la distribución irregular de orígenes
ineficientes reduce su redundancia, retrasa la finalización de la síntesis de DNA en
regiones específicas del genoma, y causa su inestabilidad. Además, impedimentos a
la progresión de horquillas añaden fragilidad adicional a estos sitios que pueden
romper en mitosis y posiblemente promover la oncogénesis.
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