Molecular determinants of strand displacement polymerization by HIV reverse transcriptases
Title (trans.)
Determinantes moleculares del desplazamiento de banda en la polimerización de DNA catalizada por transcriptasas inversas del VIHAuthor
Martín Alonso, SamaraAdvisor
Menéndez Arias, LuísEntity
UAM. Departamento de Biología Molecular; Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBM)Date
2022-12-02Funded by
Esta investigación fue financiada en parte por el Ministerio de Ciencia e Innovación del Gobierno de España (proyectos BIO2016-76716-R y PID2019-104176RB-I00/AEI/10.13039/501100011033). Asimismo, Samara Martín Alonso fue beneficiaria de un contrato de Formación de Personal Investigador, financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (FPI/BES-2017-079836) y de una beca de intercambio científico (Number 9097) financiada por la Organización Europea de Biología Molecular (EMBO)Subjects
ARN-Aspectos genéticos; Transcriptasa inversa; VIH (Virus); Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de Lectura: 02-12-2022Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 02-06-2024
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
In retroviruses, strand displacement DNA polymerization catalyzed by the reverse
transcriptase (RT) is needed for synthesizing double-stranded proviral DNA. This activity is also
critical to generate high-quality cDNA for use in biotechnology.
After screening a panel of purified enzymes, several HIV RTs with a defective strand
displacement phenotype have been identified using DNA and RNA as templates. Defective
strand displacement HIV-2ROD RTs contained one or more amino acid substitutions in the
fingers subdomain, including thymidine analogue resistance-associated mutations (TAMs).
Combinations of different TAMs in HIV-1 (i.e., M41L, D67N, K70R, L210W, or T215F/Y) confer
resistance to zidovudine and other thymidine analogues and have been associated with
resistance to the antiretroviral treatment. However, they are rarely found in HIV-2. Results
revealed that the largest defects in strand displacement and the lowest nucleotide
incorporation rates were obtained in reactions catalyzed by HIV-2ROD RT mutants
D67N/K70R/S215Y and M41L/D67N/K70R/S215Y, under strand displacement conditions.
In HIV-1, the presence of TAMs had no effect on strand displacement activity. In contrast,
loss of RNase H activity by mutational inactivation (e.g., substitutions D443N or E478Q)
produced a pronounced defect on strand displacement when using RNA templates that was
not observed with DNA templates. Similar effects were obtained using β-thujaplicinol and
other previously characterized RNase H active site inhibitors. Some of them were also
inhibitors of the HIV-1 integrase and/or the viral RT DNA polymerase. Among them, dual
inhibitors of RT DNA polymerase/RNase H activities, containing a 7-hydroxy-6-nitro-2Hchromen-
2-one pharmacophore (coumarin derivatives DW3 and K04-9) were the most potent
strand displacement inhibitors.
Finally, RNA modification detection and their precise localization is currently a field of high
interest but fraught with technical pitfalls during RNA libraries preparation due to the inability
of the RTs to form a base pair with some modified bases. MMLV ProtoScript II RT showed a
large reduction of the mismatch rates at modified sites tested as the reaction temperature
increases. While HIV RTs exhibited higher mismatch rates and introduced a higher number
of deletions compared to MMLV ProtoScript II. These data suggest the high processivity
and read-through capability of the HIV RTs for use in RNA sequencing when using modified
templates En retrovirus, el desplazamiento de banda en la polimerización del ADN catalizada por la
transcriptasa inversa (RT) es necesario para sintetizar el ADN proviral de doble cadena. Esta
actividad también es crucial para generar ADNc de alta calidad para su uso en biotecnología.
Después de cribar un panel de enzimas purificadas, se han identificado varias RTs del VIH con
un fenotipo de desplazamiento de banda defectuoso utilizando ADN y ARN como moldes. Las
RTs del VIH-2ROD con menor capacidad de desplazamiento de banda contenían una o más
sustituciones de aminoácidos en el subdominio fingers, incluidas mutaciones asociadas a
resistencia a análogos de timidina (TAMs). Combinaciones de diferentes TAMs en el VIH-1 (i.e.
M41L, D67N, K70R, L210W o T215F/Y) confieren resistencia a zidovudina y otros análogos de
timidina y se han asociado a la resistencia al tratamiento antirretroviral. Sin embargo, rara vez
se encuentran en el VIH-2. Los mayores defectos de desplazamiento de banda y las menores
tasas de incorporación de nucleótido se obtuvieron en reacciones catalizadas por las RTs
mutantes del VIH-2ROD D67N/K70R/S215Y y M41L/D67N/K70R/S215Y en condiciones de
desplazamiento de banda.
En el VIH-1, la presencia de TAMs no tuvo ningún efecto sobre la actividad de
desplazamiento de banda. En cambio, la pérdida de la actividad RNasa H por inactivación
mutacional (p. ej. con las sustituciones D443N o E478Q) produjo un defecto pronunciado en el
desplazamiento de banda cuando se utilizaron moldes de ARN, que no se observó con moldes
ADN. Efectos similares fueron obtenidos usando β-thujaplicinol y otros inhibidores del centro
activo de la RNasa H previamente caracterizados. Algunos de ellos eran también inhibidores de
la integrasa del VIH-1 y/o de la ADN polimerasa de la RT viral. Entre ellos, inhibidores duales de
las actividades ADN polimerasa/RNasa H de la RT, que contienen un farmacóforo 7-hidroxi-6-
nitro-2H-cromo-2-ona (como los derivados de cumarina DW3 y K04-9), fueron los inhibidores
más potentes del desplazamiento de banda.
Por último, la detección de modificaciones del ARN y su localización precisa es un campo de
gran interés actualmente, pero lleno de escollos técnicos durante la preparación de librerías de
ARN debido a la incapacidad de la RT para formar pares de bases con algunas bases
modificadas. La RT del MMLV ProtoScript II mostró una gran reducción de las tasas de error en
los sitios modificados analizados al aumentar la temperatura de reacción. Mientras que las RTs
del VIH mostraron tasas de error más altas e introdujeron un mayor número de deleciones
comparadas con MMLV ProtoScript II. Estos datos sugieren la alta procesividad y capacidad de
lectura de las RTs del VIH para su uso en secuenciación de ARN utilizando moldes modificados
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