Use of the Sleeping Beauty transposon system to identify new genes involved in skin and breast cancer
Author
Quintana Portilla, RitaEntity
UAM. Departamento de Biología Molecular; Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas (CIEMAT)Date
2012-11-20Subjects
Piel - Cáncer - Aspectos genéticos - Tesis doctorales; Mamas - Cáncer - Aspectos genéticos - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita. Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 20-11-2012
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Abstract
New high throughput technologies have made it possible to screen complete cancer genomes for
identification of mutations associated to cancer. These analyses have pointed out that there are
only a few commonly mutated genes and many infrequently mutated genes, highlighting the
heterogeneity in the genes that cause cancer. The validation of the possible role for each of these
genes in cancer is a difficult task, considering the existence of driver mutations and many
“passenger” mutations in cancer genomes. To overcome these difficulties, comparative
genomics has proved to be a useful tool when looking for candidate cancer genes that are
mutated in tumors that arise in model mice. Transposons represent important genetic tools for
functional genomic screening and recently the Sleeping Beauty transposon system, which can
act as an insertional mutagen, has been developed to mutate and identify novel cancer genes in
transgenic mice. The major aim of this project is to identify novel cancer genes involved in the
development of two tumor types that are incompletely characterized at genetic level: nonmelanoma
skin cancer and breast cancer malignancies. For this purpose, we have used the
Sleeping Beauty transposon system to identify somatic mutations associated with skin and
breast cancers.
We generated transgenic mice carrying multiple copies of the mutagenic transposon T2Onc2
and expressing the SB11 transposase specifically in tissues where keratin K5 is expressed
(SB/T2 mice). When these mice were subjected to several skin carcinogenesis regimes, they
developed more tumors than mice lacking active transposons in the skin. Moreover, these
tumors showed worse histological characteristics than those obtained in control mice,
presumably as a result of the mutagenic effect of transposon mobilization. Genetic analysis of
the transposon insertion sites in the tumors identified 126 genes recurrently mutated in different
tumor samples, which may represent candidate cancer genes. When the expression levels of a
subset of the most transposon-mutated genes were analyzed in skin human samples, we detected
alterations in the expression levels of some of these genes in human tumors. Our results show
that inactivating mutations in Notch1, Nsd1 among others, may have an important role in skin
carcinogenesis. We also generated heterozygous p53+/- mice bearing multiple copies of the
T2Onc2 transposon and the SB11 transposase. These mice developed mammary gland
carcinomas with higher incidence and shorter latency period than control mice that did not
undergo transposition. High throughput sequencing analysis of the transposon insertion sites
within the tumors identified 53 candidate cancer genes that were commonly mutated in different
transposon/transposase tumor samples. Immunohistrochemical analyses revealed that NF1 and
RASA1 (two of the most frequently transposon-mutated genes in our animal model) were
expressed at a reduced level in human breast tumor samples. Therefore, this study shows that
NF1 and RASA1 may be important for breast cancer development. Las nuevas técnicas de secuenciación masiva han posibilitado el análisis genómico de tumores
para identificar mutaciones asociadas a cáncer. Estos análisis han averiguado que hay un
número pequeño de genes mutados frecuentemente y gran número de genes mutados
infrecuentemente, poniendo de manifiesto la heterogeneidad de los genes que causan cáncer. La
validación del posible papel de cada uno de estos genes en cáncer es una tarea difícil, ya que
hay mutaciones conductoras y pasajeras en los genomas de cáncer. Para vencer estas
dificultades, la genómica comparativa ha demostrado ser una herramienta muy útil para la
búsqueda de genes importantes en el desarrollo del cáncer, a través de la determinación de los
genes mutados en tumores originados en modelos de ratón. Por otra parte, los transposones
representan herramientas genéticas muy importantes para el análisis genómico; recientemente se
ha desarrollado el sistema de transposición “Sleeping Beauty” (SB) para mutar e identificar
nuevos genes implicados en cáncer en modelos animales. Finalmente, tanto el cáncer de piel (no
melanoma) como el cáncer de mama están incompletamente caracterizados a nivel genético. El
principal objetivo de este trabajo es la identificación de mutaciones somáticas asociadas a estos
dos tipos de cáncer mediante el uso del sistema de transposición SB en ratones transgénicos.
Hemos generado ratones transgénicos portadores de múltiples copias de un transposón
mutagénico y de la transposasa necesaria para su movilización específicamente en tejidos donde
se expresa la queratina K5 (ratones SB/T2). Cuando estos ratones fueron sometidos a varios
protocolos de carcinogénesis de piel, desarrollaron más tumores que ratones sin transposones
activos en piel. Además, estos tumores presentaron peores características histopatológicas que
los obtenidos en animales control. El análisis de los sitios de inserción del transposón en los
tumores identificó 126 genes mutados de manera recurrente. Estos genes son candidatos a
desempeñar un papel importante en el desarrollo tumoral. Nuestros resultados muestran que
mutaciones que inactivan NOTCH1 y NSD1, entre otros genes, puede ser importante para la
carcinogénesis de piel.
También hemos generado ratones SB/T2 en un fondo genético heterocigoto para Trp53. Estos
ratones desarrollaron carcinomas de glándula mamaria con mayor incidencia y menor latencia
que ratones sin transposición activa. El análisis de los sitios de inserción en los tumores
mamarios por secuenciación masiva identificó 53 genes candidatos de cáncer que estaban
mutados de manera recurrente en diferentes tumores. Estudios inmunohistoquímicos pusieron
de manifiesto que dos de los genes más mutados por el transposón en nuestro modelo animal
(en concreto NF1 y RASA1) se expresan a menor nivel en muestras humanas de cáncer de
mama que en tejido no tumoral. Estos resultados indican que NF1 y RASA1 pueden ser
importantes para el desarrollo del cáncer de mama.
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