Use of the Sleeping Beauty transposon system to identify new genes involved in skin and breast cancer

Abstract

New high throughput technologies have made it possible to screen complete cancer genomes for identification of mutations associated to cancer. These analyses have pointed out that there are only a few commonly mutated genes and many infrequently mutated genes, highlighting the heterogeneity in the genes that cause cancer. The validation of the possible role for each of these genes in cancer is a difficult task, considering the existence of driver mutations and many “passenger” mutations in cancer genomes. To overcome these difficulties, comparative genomics has proved to be a useful tool when looking for candidate cancer genes that are mutated in tumors that arise in model mice. Transposons represent important genetic tools for functional genomic screening and recently the Sleeping Beauty transposon system, which can act as an insertional mutagen, has been developed to mutate and identify novel cancer genes in transgenic mice. The major aim of this project is to identify novel cancer genes involved in the development of two tumor types that are incompletely characterized at genetic level: nonmelanoma skin cancer and breast cancer malignancies. For this purpose, we have used the Sleeping Beauty transposon system to identify somatic mutations associated with skin and breast cancers. We generated transgenic mice carrying multiple copies of the mutagenic transposon T2Onc2 and expressing the SB11 transposase specifically in tissues where keratin K5 is expressed (SB/T2 mice). When these mice were subjected to several skin carcinogenesis regimes, they developed more tumors than mice lacking active transposons in the skin. Moreover, these tumors showed worse histological characteristics than those obtained in control mice, presumably as a result of the mutagenic effect of transposon mobilization. Genetic analysis of the transposon insertion sites in the tumors identified 126 genes recurrently mutated in different tumor samples, which may represent candidate cancer genes. When the expression levels of a subset of the most transposon-mutated genes were analyzed in skin human samples, we detected alterations in the expression levels of some of these genes in human tumors. Our results show that inactivating mutations in Notch1, Nsd1 among others, may have an important role in skin carcinogenesis. We also generated heterozygous p53+/- mice bearing multiple copies of the T2Onc2 transposon and the SB11 transposase. These mice developed mammary gland carcinomas with higher incidence and shorter latency period than control mice that did not undergo transposition. High throughput sequencing analysis of the transposon insertion sites within the tumors identified 53 candidate cancer genes that were commonly mutated in different transposon/transposase tumor samples. Immunohistrochemical analyses revealed that NF1 and RASA1 (two of the most frequently transposon-mutated genes in our animal model) were expressed at a reduced level in human breast tumor samples. Therefore, this study shows that NF1 and RASA1 may be important for breast cancer development.

Las nuevas técnicas de secuenciación masiva han posibilitado el análisis genómico de tumores para identificar mutaciones asociadas a cáncer. Estos análisis han averiguado que hay un número pequeño de genes mutados frecuentemente y gran número de genes mutados infrecuentemente, poniendo de manifiesto la heterogeneidad de los genes que causan cáncer. La validación del posible papel de cada uno de estos genes en cáncer es una tarea difícil, ya que hay mutaciones conductoras y pasajeras en los genomas de cáncer. Para vencer estas dificultades, la genómica comparativa ha demostrado ser una herramienta muy útil para la búsqueda de genes importantes en el desarrollo del cáncer, a través de la determinación de los genes mutados en tumores originados en modelos de ratón. Por otra parte, los transposones representan herramientas genéticas muy importantes para el análisis genómico; recientemente se ha desarrollado el sistema de transposición “Sleeping Beauty” (SB) para mutar e identificar nuevos genes implicados en cáncer en modelos animales. Finalmente, tanto el cáncer de piel (no melanoma) como el cáncer de mama están incompletamente caracterizados a nivel genético. El principal objetivo de este trabajo es la identificación de mutaciones somáticas asociadas a estos dos tipos de cáncer mediante el uso del sistema de transposición SB en ratones transgénicos. Hemos generado ratones transgénicos portadores de múltiples copias de un transposón mutagénico y de la transposasa necesaria para su movilización específicamente en tejidos donde se expresa la queratina K5 (ratones SB/T2). Cuando estos ratones fueron sometidos a varios protocolos de carcinogénesis de piel, desarrollaron más tumores que ratones sin transposones activos en piel. Además, estos tumores presentaron peores características histopatológicas que los obtenidos en animales control. El análisis de los sitios de inserción del transposón en los tumores identificó 126 genes mutados de manera recurrente. Estos genes son candidatos a desempeñar un papel importante en el desarrollo tumoral. Nuestros resultados muestran que mutaciones que inactivan NOTCH1 y NSD1, entre otros genes, puede ser importante para la carcinogénesis de piel. También hemos generado ratones SB/T2 en un fondo genético heterocigoto para Trp53. Estos ratones desarrollaron carcinomas de glándula mamaria con mayor incidencia y menor latencia que ratones sin transposición activa. El análisis de los sitios de inserción en los tumores mamarios por secuenciación masiva identificó 53 genes candidatos de cáncer que estaban mutados de manera recurrente en diferentes tumores. Estudios inmunohistoquímicos pusieron de manifiesto que dos de los genes más mutados por el transposón en nuestro modelo animal (en concreto NF1 y RASA1) se expresan a menor nivel en muestras humanas de cáncer de mama que en tejido no tumoral. Estos resultados indican que NF1 y RASA1 pueden ser importantes para el desarrollo del cáncer de mama.