Nuevas estrategias para incrementar la eficacia de la terapia fotodinámica

Abstract

La terapia fotodinámica (TFD) es una modalidad terapéutica clínicamente aprobada para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una proliferación celular incontrolada, principalmente el cáncer. Esta terapia induce una acción citotóxica selectiva hacia células tumorales mediante el efecto combinado de tres elementos: un fotosensibilizador (FS), luz y oxígeno. Las numerosas deficiencias que presentan las terapias aprobadas para el tratamiento del cáncer, incluida la TFD, han conducido al desarrollo de nuevas estrategias más específicas y eficaces. Centrándonos en la TFD, existen múltiples abordajes para intentar incrementar su eficacia, incluyendo: i) buscar FSs óptimos, ii) incrementar su especificidad de acumulación en las áreas tumorales, y iii) administrar dos FSs, con distinta diana terapéutica y distinto mecanismo de acción, de forma similar a los protocolos clínicos utilizados en quimioterapia. Los estudios relacionados con la síntesis y la administración de nuevos FSs, resultan fundamentales para el desarrollo de esta terapia. Por ello, en el presente trabajo de investigación se han analizado las propiedades fotobiológicas del porficeno 2,7,12-tris(α-piridinio-p-tolil)-17-(pmetoximetil) fenil), a fin de evaluar su potencial como un nuevo agente para TFD. Los resultados obtenidos han indicado que, este compuesto cumple muchas de las características requeridas para ser considerado un buen FS, induciendo una masiva y eficiente muerte celular en células tumorales en cultivo, utilizando protocolos experimentales menores, en relación con otros FSs aprobados en TFD clínica. El punto central de la presente Tesis Doctoral fue analizar los efectos inducidos por tratamientos fotodinámicos basados en la administración simultánea de dos FSs, el derivado metálico de Zinc(II) y la porfirina meso-tetra(4-N-metilpiridil)porfina (TMPyP). Los estudios se han centrado en diferentes líneas celulares establecidas (humanas y murinas), empleando cultivos celulares 2D y 3D, así como modelos murinos (ratones C57BL/6 portadores de un melanoma amelanótico). Después de los numerosos ensayos realizados, se detectó que el protocolo fotodinámico combinado inducía un efecto letal y sinérgico empleando parámetros (concentración de FS y dosis de luz) más bajos que los empleados habitualmente. Por otra parte, dicho tratamiento sin posterior irradiación, no inducía citotoxicidad. Asimismo, se ha comprobado que la fotoinactivación celular se producía mayoritariamente por apoptosis o necrosis, en función de la intensidad del tratamiento fotodinámico aplicado. Además, se detectaron alteraciones en el citoesqueleto y en diversas proteínas de adhesión. Por otra parte, los estudios farmacocinéticos llevados a cabo in vivo, mostraron una acumulación muy selectiva de ambos FSs en el tejido tumoral. Además, el tratamiento de TFD combinado reveló una inhibición significativa del crecimiento del tumor en comparación con la monoterapia. Por lo tanto, este novedoso enfoque puede ser una herramienta muy útil en futuras aplicaciones clínicas de TFD, permitiendo incrementar la eficacia terapéutica de los distintos tratamientos. Por otro lado, se ha analizado la eficacia de las nanopartículas mesopososas de sílice (MSNPs), como un posible sistema de administración de FSs. Los resultados obtenidos han demostrado, que bajo nuestras condiciones experimentales, las MSNPs incrementan la acción fotodinámica del TMPyP. Por último, teniendo en cuenta que los ensayos preclínicos se desarrollan habitualmente utilizando sistemas de cultivos celulares bidimensionales (2D), que no logran reproducir con precisión la complejidad de los tejidos, hemos desarrollado diversos modelos celulares tridimensionales (3D), como una herramienta fundamental e imprescindible en los estudios de los nuevos protocolos de TFD. Los resultados han revelado que los modelos 3D actúan de puente entre los cultivos celulares 2D y los modelos experimentales in vivo ya que pueden imitar el patrón de expresión génica y los gradientes moleculares de estos sistemas. En resumen los resultados presentados en la presente Tesis Doctoral indican que, el desarrollo de la TFD requiere múltiples abordajes que permitan: i) diseñar el FS, o la combinación de FSs, que ejerzan un mayor efecto fototóxico, ii) seleccionar los métodos de transporte más idóneos para los mismos, posiblemente nanoplataformas funcionalizadas, que permitan una acumulación selectiva en el tejido tumoral, para inducir los mínimos efectos secundarios y, iii) diseñar protocolos experimentales enfocados a una terapia oncológica personalizada (en función de las características genéticas del tumor a tratar), incluyendo su combinación con las terapias oncológicas habituales. Dichos protocolos deberán ser ensayados en cultivos 3D antes de evaluar su eficacia en modelos animales.

Photodynamic therapy (PDT) is a clinically approved therapeutic modality for the treatment of diseases characterized by uncontrolled cell proliferation, mainly cancer. This therapy induces a selective cytotoxic activity toward tumor cells by the combined effect of three components: a photosensitizer (PS), light and oxygen. The numerous deficiency and several disadvantages of approved oncologic therapeutic modalities, including PDT, have led to the development of more specific and effective strategies. Focusing on the PDT, there are multiple approaches in order to increase their efficacy, including: i) a search for ideal PSs, ii) ) to enhance accumulation preferentially within tumor area, and iii) simultaneous administration of two photosensitizers with different therapeutic target and diverse mechanism of action, in a similar way to clinical chemotherapy protocols. Studies related to the synthesis and administration of new PSs, are fundamental for the development of this therapy. Therefore, in this study we have analyzed the photobiological properties of 2,7,12-tris(α-pyridinio-p-tolyl)-17-(p-methoxymethyl)phenyl) porphycene, in order to assess its potential as a new PDT agent. In summary, this compound is endowed with many of the properties required to be considered a good PS, inducing a massive and efficient cell death in tumor cells, in comparison to approved PSs for clinical use in PDT. The focus of this PhD thesis was to analyze to evaluate in depth the efficacy of PDT-treatments based on the simultaneous administration of two PSs, the Zinc(II)-phthalocyanine and and the cationic porphyrin meso-tetrakis(4-N-methylpyridyl)porphine (TMPyP). The studies were carried out on different established cell lines (human and murine) using 2D and 3D cellular systems and murine models (C57BL/6 mice bearing an amelanotic melanoma). After numerous assays, it was observed that the combined photodynamic protocol induced a lethal and synergistic effect using parameters (PS concentration and light dose) lower than those commonly used. On the other hand, we did not observed any dark toxicity. Also, we detected changes from predominant apoptosis (without cell detachment) to predominant necrosis, depending on the intensity of the PDT treatment. Furthermore, alterations in cytoskeleton components and in different adhesion proteins were detected. Finally, pharmacokinetic studies carried out in vivo, showed a highly selective accumulation of both PSs in tumor area. Moreover, the combined PDT treatment revealed a significant tumor growth inhibition compared to monotherapy. Thus, this novel approach can be a very useful tool in future PDT clinical applications, thereby increasing the therapeutic efficacy of different treatments. Moreover, we analyzed the efficacy of mesopososas silica nanoparticles (MSNPs), as a potential delivery system for PSs. The results obtained showed that, under our experimental conditions, MSNPs increase the photodynamic action of TMPyP. Finally, considering that preclinical tests have traditionally been developed using two-dimensional cellular systems (2D), which are unable to accurately represent the complexity of tissues, we showed the development of different three-dimensional models (3D), as a fundamental and essential tool in studies for new drugs screening. The results revealed that the 3D models act as a bridge between 2D cell cultures and in vivo experimental models as they can mimic in vivo gene expression pattern and molecular gradients of these systems.