Papel de la vía endocítica en la infección del virus de la peste porcina africana

Abstract

En este trabajo de tesis hemos caracterizado que la infección del virus de la peste porcina africana (VPPA) es dependiente de la vía endocítica. Una vez el VPPA se internaliza en las células, se incorpora inmediatamente a la vía endocítica. Esta vía comprende una serie de vesículas que sufren cambios madurativos altamente regulados por las Rab GTPasas y los fosfoinosítidos (FIs). Estos cambios modifican las características fisiológicas de las vesículas endocíticas a lo largo del proceso de maduración. La infección, comienza con el paso del VPPA por los endosomas tempranos (EE), dada la elevada colocalización entre el virus con estas vesículas desde los primeros minutos de la infección. Posteriormente, el VPPA alcanzaba los endosomas tardíos (LE), donde se producía la desencapsidación de un modo dependiente de pH ácido antes de la primera hora post infección. La señalización relacionada con la vía endocítica era crucial para el éxito de la infección, en concreto una diana molecular de gran relevancia, la GTPasa Rab7, reguladora de la dinámica del LE. La infectividad del VPPA resultaba severamente afectada cuando se anulaba la función de la GTPasa Rab7. Otra señalización relevante para el LE es dependiente del fosfatidil inositol 3,5 bifosfato. El bloqueo de la síntesis de este FI, especialmente antes de la infección, producía una disminución de la expresión de proteínas virales y de la producción viral. Una de las etapas cruciales de la infección, correspondió a los cuerpos multivesiculares (MBVs), un estadío madurativo intermedio, previo al LE. Los MBVs se caracterizan por presentar numerosas vesículas intraluminales (ILVs) en su interior. Las ILVs están enriquecidas por un lípido no convencional, el ácido lisobisfosfatídico (LBPA). Al anular su acción mediante un anticuerpo bloqueante, se afectaba la capacidad infectiva del virus. Asimismo, se demostró que la infección por VPPA en sus primeras etapas era altamente dependiente del flujo de colesterol libre desde los endosomas (LE) hacia sus destinos celulares. Las mencionadas moléculas de señalización de la vía endocítica son dianas moleculares para el virus y las membranas endosomales podrían jugar un papel como plataformas para la formación de la organela de replicación viral (ORV) o factoría vírica. Hasta ahora, se consideraba que las ORVs eran acúmulos de proteínas y DNA viral en los que no podía detectarse ninguna organela a excepción de ribosomas. Sin embargo, hemos descrito por primera vez, que las membranas endosomales se encuentran entremezcladas con los focos de acúmulo de proteínas víricas en las fases iniciales de su formación. Además, la formación de la factoría del VPPA conlleva una redistribución de todos los compartimentos endosomales hacia el área donde se constituye el complejo de ensamblaje del virus, resultando fundamental en las etapas iniciales de la infección por VPPA.

In this thesis we have characterized the dependence of the African swine fever virus (ASFV) infection on the endocytic pathway. Once ASFV is internalized into cells, it is immediately incorporated to the endocytic pathway. This pathway comprises a number of vesicles undergoing maturational changes highly regulated by Rab GTPases and phosphoinositides (PIs). These changes modify the physiological characteristics of the endocytic vesicles along the maturation process. Infection begins with the passage of ASFV through early endosomes (EE), given the high colocalization between virus proteins and these vesicles found from the first 30 minutes of infection. Subsequently, according to our results, ASFV reaches the late endosomes (LE) where desencapsidation occurs in an acid pH-dependent manner before the first hour post infection. The endocytic pathway related signaling is crucial for a successful ASFV infection, specifically a highly relevant molecular target is the GTPase Rab7, regulating dynamics of LE. ASFV infectivity was severely affected when impairing the Rab7 function. Another relevant LE signaling was phosphatidylinositol 3,5 bisphosphate dependent. Blocking the synthesis of this PI, especially starting before infection, caused a severe decrease in viral protein expression and virus production. A crucial endosomal stage for ASFV infection corresponded to multivesicular bodies (MBV), an intermediate maturation stage prior to LE. MBVs are characterized by numerous intraluminal vesicles (ILVs). ILVs are enriched by an unconventional lipid, the lysobisphosphatidic acid (LBPA) which directly correlates with intracellular cholesterol levels. By withdrawing its action with a blocking antibody, virus infectivity was also affected. Furthermore, it was demonstrated that ASFV infection at its early stages was highly dependent on the flow of free cholesterol from LE to their cell destinations. The mentioned signaling molecules of the endocytic pathway might are molecular targets for the virus. Also, endosomal membranes might play a role as a scaffold for the formation of viral replication organelle or viral factory. Until now, it was assumed that viral factories were composed by proteins and viral DNA in bulk accumulations, in which no organelle could be detected, exception made for ribosomes. However, we have described for first time that endosomal membranes were found interspersed between early aggregates of viral proteins accumulation at the initial stages of the viral replication site formation, which is microtubule dependent. Furthermore, the formation of ASFV factory entailed redistribution of all endosomal compartments to the area where the assembly complex of the virus is constituted, resulting in a key process for ASFV infection.