Evaluación del metabolismo del glutatión en la tolerancia a metales pesados
Author
Sobrino Plata, JuanEntity
UAM. Departamento de BiologíaDate
2014-02-14Subjects
Plantas, Efectos de los metales sobre las - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología. Fecha de lectura: 14-02-2014
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Abstract
Se estudiaron las respuestas de estrés oxidativo inducido por cadmio (Cd) y mercurio (Hg), característico
síntoma de toxicidad por metales, en plantas de alfalfa crecidas en un medio semi-hidropónico con
diferentes dosis de metal (0, 3, 10 y 30 μM) durante una semana. Ambos metales produjeron alteraciones
en enzimas antioxidantes, siendo el Hg más tóxico que el Cd, destacando la inhibición de la actividad
glutatión reductasa (GR), mientras que con Cd hubo mayor síntesis de fitoquelatinas (PCs). Estás
diferencias en los mecanismos de toxicidad nos llevó a plantear la posibilidad de identificar las firmas de
estrés específicas para elementos tóxicos (Cd, Hg y arsénico (As); 0, 6 y 30 μM) en la planta metalofita
Silene vulgaris. Tras una semana de exposición, se confirmó que la inhibición de GR era un indicador
específico de estrés por Hg, siendo de nuevo importante la producción de PCs en plantas tratadas con Cd.
Asimismo, el Cd produjo fotoinhibición y alteración en proteínas relacionadas con el aparato fotosintético,
lo que pudo estar relacionado con la mayor translocación de este metal a hoja. La evidente implicación del
GSH y otros biotioles en la respuesta a metal(loide)s tóxicos nos llevó a plantear el experimentos
funcionales para caracterizar en detalle su contribución en las respuestas Cd y Hg, para lo que utilizaron
mutantes de Arabidopsis thaliana con niveles alterados de GSH y biotioles frente al ecotipo silvestre (Col-
0). Se trabajó con tres alelos mutantes de la enzima γ-glutamilcisteina sintetasa (γECS), pad2-1, cad2-1, y
rax1-1 (acumulan 20, 30 y 45% del GSH detectado en Col-0, respectivamente); y un mutante defectivo en
fitoquelatina sintasa (PCS) cad1-3 (que no acumula PCs). Se diseñaron dos aproximaciones distintas, por
un lado se infiltraron hojas de plantas Col-0, cad2-1, rax1-1 y cad1-3 o se cultivaron en un sistema
hidropónico puro con Cd y Hg (0, 3, 10 o 30 μM) durante 24-72 h. Se observó que pequeñas diferencias
en el contenido de GSH hace que la planta se enfrente al estrés de diferente manera, teniendo
comportamientos similares a Col-0 en rax1-1, mientras que pad2-1 mostró la mayor sensibilidad. También
se estudió el perfil transcripcional de genes de la ruta de asimilación de azufre y metabolismo del GSH en
plantas de Arabidopsis Col-0, mutante de γECS y cad1-3, tratadas con un nivel moderado de Hg (3 μM)
durante 72 h. Se confirmó que los mutantes cad2-1 y pad2-1 fueron particularmente sensibles a Hg, al
tiempo que es importante el nivel de GSH en el patrón de expresión génica. Nuestros datos apoyan la
noción de un umbral crítico de concentración de GSH, observada en los mutantes rax1-1 con niveles de
GSH más parecidos a Col-0, que permite tolerancia a Cd y Hg. Se ha puesto de manifiesto la importancia
del GSH en la tolerancia, tanto a nivel del ajuste metabólico de la respuesta, como en la capacidad de
absorción y transporte de metales y metaloides tóxicos, observándose respuestas específicas para cada
contaminante. Esta información puede ser útil para la optimización de estrategias de descontaminación de
suelos contaminados por elementos tóxicos mediante fitorremediación. We studied the responses of oxidative stress induced by cadmium (Cd) and mercury (Hg), a characteristic
symptom of metal toxicity, in alfalfa plants grown on a semi-hydroponic medium with different doses of
metal (0, 3, 10 and 30 μM) for a week. Both metals produced alterations in antioxidant enzymes, being Hg
more toxic than Cd, in particular the strong inhibition of glutathione reductase (GR) activity, while there
was greater synthesis of phytochelatins (PCs) with Cd. The observed differences in the mechanisms of
toxicity led us to identifying the specific stress signatures for different toxic elements (Cd, Hg and arsenic
(As); 0, 6 and 30 μM) in the metallophyte Silene vulgaris. After a week of exposure, we confirmed that
GR inhibition was a specific indicator of stress by Hg, being Cd a potent inductor of PCs production.
Cadmium also caused photoinhibition and alteration in proteins related to the photosynthetic apparatus,
which could be related to increased translocation of this metal to the shoot. The involvement of GSH and
other biothiols in response to toxic metal(loid)s prompted us to perform functional experiments to
characterize in detail its contribution in the responses to Cd and Hg, using mutants of Arabidopsis thaliana
with altered levels of GSH and biothiols compared with the wild type (Col-0). We studied three mutant
alleles of the enzyme γ-glutamylcysteine synthetase (γECS), pad2-1, cad2-1and rax1-1 (that contain 20,
30 and 45% of Col-0 GSH levels, respectively); and a mutant defective in phytochelatin synthase (PCS)
cad1-3 (does not accumulate PCs). Two different approaches were designed, on the one hand infiltrated
leaves of plants Col-0, cad2-1, rax1-1 and cad1-3, or were cultivated in a pure hydroponic system with Cd
and Hg (0, 3, 10 or 30 μM) for 24-72 h. It was observed that small differences in the content of GSH
makes the plant to face stress differently, showing similar behaviors Col-0 and rax1 -1, while pad2-1 was
more sensitivity. It was also studied the transcriptional profile of genes of the assimilation of sulfur
pathway and GSH metabolism in Arabidopsis Col-0, the γECS mutant plants of and cad1-3, treated with a
moderate level of Hg (3 μM) for 72 h. It was confirmed that the cad2-1 and pad2-1 mutants were
particularly sensitive to Hg, at the time that the level of GSH is important for the gene expression profile.
Our data support the notion of a critical threshold of GSH concentration, observed in the rax1-1 mutant
with GSH levels more similar to Col-0, which allows tolerance to Cd and Hg. It has been highlighted the
importance of GSH in tolerance, both at the level of metabolic adjustment of the response, and at the level
of toxic metal and metalloids absorption and transport, with specific responses for each pollutant. This
information can be useful for the optimization of the decontamination strategies of soils polluted with
toxic elements using phytoremediation technologies.
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