Evaluación del metabolismo del glutatión en la tolerancia a metales pesados

Abstract

Se estudiaron las respuestas de estrés oxidativo inducido por cadmio (Cd) y mercurio (Hg), característico síntoma de toxicidad por metales, en plantas de alfalfa crecidas en un medio semi-hidropónico con diferentes dosis de metal (0, 3, 10 y 30 μM) durante una semana. Ambos metales produjeron alteraciones en enzimas antioxidantes, siendo el Hg más tóxico que el Cd, destacando la inhibición de la actividad glutatión reductasa (GR), mientras que con Cd hubo mayor síntesis de fitoquelatinas (PCs). Estás diferencias en los mecanismos de toxicidad nos llevó a plantear la posibilidad de identificar las firmas de estrés específicas para elementos tóxicos (Cd, Hg y arsénico (As); 0, 6 y 30 μM) en la planta metalofita Silene vulgaris. Tras una semana de exposición, se confirmó que la inhibición de GR era un indicador específico de estrés por Hg, siendo de nuevo importante la producción de PCs en plantas tratadas con Cd. Asimismo, el Cd produjo fotoinhibición y alteración en proteínas relacionadas con el aparato fotosintético, lo que pudo estar relacionado con la mayor translocación de este metal a hoja. La evidente implicación del GSH y otros biotioles en la respuesta a metal(loide)s tóxicos nos llevó a plantear el experimentos funcionales para caracterizar en detalle su contribución en las respuestas Cd y Hg, para lo que utilizaron mutantes de Arabidopsis thaliana con niveles alterados de GSH y biotioles frente al ecotipo silvestre (Col- 0). Se trabajó con tres alelos mutantes de la enzima γ-glutamilcisteina sintetasa (γECS), pad2-1, cad2-1, y rax1-1 (acumulan 20, 30 y 45% del GSH detectado en Col-0, respectivamente); y un mutante defectivo en fitoquelatina sintasa (PCS) cad1-3 (que no acumula PCs). Se diseñaron dos aproximaciones distintas, por un lado se infiltraron hojas de plantas Col-0, cad2-1, rax1-1 y cad1-3 o se cultivaron en un sistema hidropónico puro con Cd y Hg (0, 3, 10 o 30 μM) durante 24-72 h. Se observó que pequeñas diferencias en el contenido de GSH hace que la planta se enfrente al estrés de diferente manera, teniendo comportamientos similares a Col-0 en rax1-1, mientras que pad2-1 mostró la mayor sensibilidad. También se estudió el perfil transcripcional de genes de la ruta de asimilación de azufre y metabolismo del GSH en plantas de Arabidopsis Col-0, mutante de γECS y cad1-3, tratadas con un nivel moderado de Hg (3 μM) durante 72 h. Se confirmó que los mutantes cad2-1 y pad2-1 fueron particularmente sensibles a Hg, al tiempo que es importante el nivel de GSH en el patrón de expresión génica. Nuestros datos apoyan la noción de un umbral crítico de concentración de GSH, observada en los mutantes rax1-1 con niveles de GSH más parecidos a Col-0, que permite tolerancia a Cd y Hg. Se ha puesto de manifiesto la importancia del GSH en la tolerancia, tanto a nivel del ajuste metabólico de la respuesta, como en la capacidad de absorción y transporte de metales y metaloides tóxicos, observándose respuestas específicas para cada contaminante. Esta información puede ser útil para la optimización de estrategias de descontaminación de suelos contaminados por elementos tóxicos mediante fitorremediación.

We studied the responses of oxidative stress induced by cadmium (Cd) and mercury (Hg), a characteristic symptom of metal toxicity, in alfalfa plants grown on a semi-hydroponic medium with different doses of metal (0, 3, 10 and 30 μM) for a week. Both metals produced alterations in antioxidant enzymes, being Hg more toxic than Cd, in particular the strong inhibition of glutathione reductase (GR) activity, while there was greater synthesis of phytochelatins (PCs) with Cd. The observed differences in the mechanisms of toxicity led us to identifying the specific stress signatures for different toxic elements (Cd, Hg and arsenic (As); 0, 6 and 30 μM) in the metallophyte Silene vulgaris. After a week of exposure, we confirmed that GR inhibition was a specific indicator of stress by Hg, being Cd a potent inductor of PCs production. Cadmium also caused photoinhibition and alteration in proteins related to the photosynthetic apparatus, which could be related to increased translocation of this metal to the shoot. The involvement of GSH and other biothiols in response to toxic metal(loid)s prompted us to perform functional experiments to characterize in detail its contribution in the responses to Cd and Hg, using mutants of Arabidopsis thaliana with altered levels of GSH and biothiols compared with the wild type (Col-0). We studied three mutant alleles of the enzyme γ-glutamylcysteine synthetase (γECS), pad2-1, cad2-1and rax1-1 (that contain 20, 30 and 45% of Col-0 GSH levels, respectively); and a mutant defective in phytochelatin synthase (PCS) cad1-3 (does not accumulate PCs). Two different approaches were designed, on the one hand infiltrated leaves of plants Col-0, cad2-1, rax1-1 and cad1-3, or were cultivated in a pure hydroponic system with Cd and Hg (0, 3, 10 or 30 μM) for 24-72 h. It was observed that small differences in the content of GSH makes the plant to face stress differently, showing similar behaviors Col-0 and rax1 -1, while pad2-1 was more sensitivity. It was also studied the transcriptional profile of genes of the assimilation of sulfur pathway and GSH metabolism in Arabidopsis Col-0, the γECS mutant plants of and cad1-3, treated with a moderate level of Hg (3 μM) for 72 h. It was confirmed that the cad2-1 and pad2-1 mutants were particularly sensitive to Hg, at the time that the level of GSH is important for the gene expression profile. Our data support the notion of a critical threshold of GSH concentration, observed in the rax1-1 mutant with GSH levels more similar to Col-0, which allows tolerance to Cd and Hg. It has been highlighted the importance of GSH in tolerance, both at the level of metabolic adjustment of the response, and at the level of toxic metal and metalloids absorption and transport, with specific responses for each pollutant. This information can be useful for the optimization of the decontamination strategies of soils polluted with toxic elements using phytoremediation technologies.