Multimodal approach to the interaction of OD15 superparamagnetic nanoparticles and MCF-7 cancer cells
Author
Chiappi, MicheleEntity
UAM. Departamento de Biología Molecular; CSIC. Centro Nacional de Biotecnología (CNB)Date
2014-06-27Subjects
Cáncer - Tratamiento - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 27-06-2014Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
Aunque
se
han
producido
importantes
avances
en
el
tratamiento
contra
el
cáncer
gracias
a
los
esfuerzos
acometidos,
esta
enfermedad
multifactorial
y
heterogénea
sigue
siendo
una
da
las
mayores
causas
de
mortalidad
en
los
países
desarrollados.
En
los
últimos
años,
diferentes
estudios
se
han
centrado
en
el
posible
uso
de
nanopartículas
paramagnéticas
de
óxido
de
hierro
(SPION,
del
inglés
superparamagnetic
iron
oxide
nanoparticles).
Dichos
estudios
han
generado
una
gran
expectación
debido
a
que
las
SPION
son
herramientas
con
prometedoras
aplicaciones
en
el
campo
de
la
biomedicina
tales
como
el
diagnóstico
por
imagen
mediante
resonancia
magnética
(MRI,
del
inglés
magnetic
resonance
imaging)
o
como
terapia
contra
el
cáncer
mediante
hipertermia
y/o
la
liberación
de
moléculas
anti-‐cancerígenas
Factores
tales
como
el
tamaño,
la
forma,
la
carga
en
superficie
y
la
funcionalización
de
nanopartículas
pueden
determinar
sus
vías
de
internalización
y
distribución
celulares
y,
por
lo
tanto,
su
rendimiento
efectivo.
Por
todo
ello,
se
requiere
un
conocimiento
más
preciso
de
los
mecanismos
de
internalización
y
distribución
intracelulares
de
las
SPION
modificadas
en
su
superficie.
Estos
estudios
requerirán
de
información
ultraestructural
del
destino
de
estas
nanopartículas
dentro
de
las
células
permitiendo
así
la
evaluación
de
su
posible
uso
en
nanomedicina.
En
este
trabajo,
se
ha
llevado
a
cabo
una
aproximación
multimodal
para
el
análisis
de
la
interacción,
internalización
y
biocompatibilidad
de
SPION
OD15
recubiertas
de
ácido
dimercaptosuccínico
(DMA-‐SPION)
en
células
de
cáncer
de
mama
MCF-‐7.
Las
nanoparticulas
de
hierro
OD15
presentan
un
diámetro
medio
de
15
nm
y
carga
negativa
en
superficie,
presentando
unas
buenas
características
de
biocompatibilidad.
Las
células
se
incubaron
con
DMSA-‐SPION
durante
distintos
intervalos
de
tiempo,
desde
0,5
a
72
h,
mostrando
una
internalización
eficaz
y
una
retirada
relativamente
lenta,
tal
y
como
confirmaron
los
ensayos
con
azul
de
Prusia
y
la
microscopía
electrónica
de
transmisión
(TEM,
del
inglés
transmission
electron
microscopy).
Los
estudios
de
absorción
mostraron
una
acumulación
máxima
de
las
SPION
en
un
área
definida
cerca
del
núcleo
y
próxima
a
la
red
del
Golgi.
Tras
una
incubación
de
24
h
su
concentración
intracelular
disminuyó
lentamente
con
las
sucesivas
divisiones
celulares.
Las
SPION
OD15
internalizadas
se
localizaron
en
el
interior
de
endosomas
tal
y
como
se
confirmó
la
visualización
mediante
TEM
y
el
ensayo
de
fluorescencia
con
la
sonda
acidotrópica
LysoTracker
Red.
Estudios
ultraestructurales
mediante
TEM
mostraron
una
absorción
de
los
grandes
agregados
de
SPION
(>
200
nm)
mediante
macropinocitosis,
mientras
que
los
pequeños
agregados
(<
200
nm)
se
internalizaron
mediante
un
proceso
mediado
por
clatrina.
La
técnica
de
criomicroscopía
de
rayos
X
(SXT)
se
empleó
en
el
análisis
a
resolución
nanométrica,
de
la
acumulación
de
la
SPION
OD15
y
la
significativa
reorganización
del
ambiente
intracelular
en
la
célula
completa
crio-‐preservada,
sin
necesidad
de
fijación
química
ni
adición
de
agentes
de
tinción.
La
microscopía
correlativa,
por
su
parte,
permitió
la
localización
de
las
células
que
contenían
SPION
acumuladas
en
los
endosomas,
ya
que
estas
habían
sido
marcadas
previamente
con
LysoTracker.
Los
volúmenes
reconstruidos
confirmaron
la
acumulación
endosomal
de
las
SPION
cerca
del
área
del
Golgi,
en
las
proximidades
del
núcleo.
De
hecho,
la
SXT
nos
permitió
llevar
a
cabo
un
análisis
cuantitativo
estadístico
de
la
acumulación
de
las
SPION
que
confirmó
un
incremento
en
el
número
y
tamaño
de
las
vesículas
desde
las
3
h
hasta
las
24
h.
Sin
embargo,
la
presencia
de
vesículas
con
elevada
absorción
en
las
células
control,
sin
una
previa
incubación
con
las
SPION
nos
indujeron
a
intentar
detectar
de
forma
inequívoca
el
hierro
dentro
de
las
células.
Para
ello
utilizamos
espectroscopía
de
absorción
de
rayos
X
(XAS,
del
inglés
X-‐ray
spectroscopy
absorption).
Mediante
esta
técnica,
adquirimos
series
de
energía
bidimensionales
y
series
de
inclinación
a
520
y
707
eV
para
su
posterior
reconstrucción
en
tres
dimensiones.
El
análisis
de
las
series
de
energía
confirmó
la
detección
específica
del
hierro
mediante
los
máximos
de
absorción
coincidiendo
con
los
perfiles
L3
y
L2
del
elemento.
Los
volúmenes
tomográficos
nos
permitieron
obtener
un
mapa
cualitativo
de
la
distribución
del
hierro
dentro
de
la
muestra. Although
huge
efforts
have
led
Correlative
microscopy
was
used
to
easily
localize
the
cells
and
the
nanoparticles
accumulated
in
endosomes
labeled
by
LysoTracker.
Reconstructed
volumes
confirmed
the
SPION-‐containing
endosomal
accumulation
near
the
Golgi
area
close
to
the
nucleus.
Moreover,
SXT
allowed
us
to
make
a
quantitative
analysis
of
the
SPION
uptake
supported
by
a
statistical
analysis
which
confirmed
an
increase
in
number
and
size
of
the
vesicles
from
3
h
to
24
h.
The
presence
of
highly
4
contrasted
vesicles
in
control
cells
without
SPION
incubation
encouraged
us
to
unambiguously
detect
the
iron
inside
cells
by
X-‐ray
spectroscopy
absorption
(XAS).
We
acquired
on
the
same
areas,
2D
energy
stacks
to
detect
the
iron
absorption
edges
L3
and
L2,
as
well
as
tilted
series
at
520
eV
(water
window)
and
707
eV
(on
the
L3
iron
edge)
to
reconstruct
3D
volumes.
These
results
allowed
us
to
obtain
a
qualitative
map
of
the
distribution
of
the
iron
element
within
the
sample
to
advances
in
cancer
treatment,
this
multifactorial
and
heterogeneous
disease
is
still
one
of
the
major
causes
of
death
in
developed
countries.
In
recent
years,
several
studies
have
focused
on
the
potential
use
of
superparamagnetic
iron
oxide
nanoparticles
(SPION).
These
studies
have
raised
great
expectations
because
SPION
are
a
promising
tool
for
biomedical
applications:
diagnosis
by
magnetic
resonance
imaging
(MRI)
and
targeted
therapy
of
cancer
by
hyperthermia
and/or
releasing
anti-‐cancer
molecules.
Factors
such
as
size,
shape,
surface
charge
and
functionalization
of
nanoparticles
can
determine
their
cellular
internalization
and
distribution,
the
main
attributes
in
their
effective
performance.
For
these
reasons,
a
precise
knowledge
of
surface
modified
SPION
interaction,
internalization
and
intracellular
fate
demands
information
at
an
ultrastructural
level
This
knowledge,
required
for
every
SPION-‐cell
model
,is
crucial
to
evaluate
their
potential
use.
We
have
analyzed
through
a
multimodal
approach
the
interaction,
internalization
and
biocompatibility
of
dimercaptosuccinic
acid-‐coated
superparamagnetic
iron
oxide
nanoparticles
(DMSA-‐SPION),
with
an
average
diameter
of
15
nm
and
negative
surface
charge,
and
MCF-‐7
breast
cancer
cells.
The
cells
were
incubated
with
DMSA-‐SPION
for
different
time
intervals,
ranging
from
0.5
to
72
h.
SPION-‐DMSA
showed
efficient
internalization
and
relatively
slow
clearance,
as
confirmed
by
Prussian
blue
staining
and
transmission
electron
microscopy
(TEM).
Time-‐dependent
uptake
studies
showed
the
maximum
accumulation
of
SPION
at
a
perinuclear
area
near
the
Golgi
network
after
24
h
of
incubation.
After
that
time,
their
intracellular
concentration
slowly
decreased
by
multiple
cell
divisions.
Internalized
SPION
were
localized
in
endosomes,
as
confirmed
by
the
acidotropic
probe
LysoTracker
Red
and
TEM
visualization.
TEM
ultrascructural
analysis
showed
macropinocytosis
uptake
for
larger
SPION
aggregates
(>
200
nm)
and
clathrin
mediated
internalization
of
small
SPION
aggregates
(<
200
nm).
Soft
X-‐ray
cryo-‐tomography
(SXT)
was
used
to
analyze,
at
nanometric
3D
resolution,
the
accumulation
of
SPION
and
the
significant
reorganization
of
the
intracellular
environment
in
whole
hydrated
cells
without
chemical
fixation
or
staining
agents.
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