Fosforilación de la conexina-32 por el receptor del factor de crecimiento epidérmico
Author
Díez Iriondo, Juan AntonioAdvisor
Villalobo Polo, Juan AntonioEntity
UAM. Departamento de Bioquímica; Instituto de Investigaciones Biomédicas "Alberto Sols" (IIBM)Date
1994-11-04Subjects
Proteínas quinasas-Tesis doctorales; Fosforilación-Tesis doctorales; Factor de crecimiento epidérmico-Tesis doctorales; Proteina-tirosina quinasa-Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 4-11-1994Abstract
En este trabajo se han aislado uniones comunicantes a partir de membranas
plasmáticas de higado de rata, se ha determinado su grado de pureza y se ha
analizado su organización estructural en placas.
Estas uniones comunicantes purificadas se reconstituyeron en liposornas, y
la permeabilidad a través del canal que forman se analizó mediante la
difusión de ascorbato hasta el lumen de los liposomas y reducción del
citocromo c encapsulado en el interior de los mismos. La permeabilidad a
través de los canales de las uniones comunicantes resultó ser dependiente
de la temperatura, mostrando la representación de Arrhenius correspondiente
al proceso una recta bifásica, a partir de la cual se calcularon una
temperatura de transición de 28,2° C y unas energias de activación, por
encima y por debajo de esta temperatura, de 28,8 kj/mol (6,9 kcal/mol) y
15, 6 kJ/mol (3,7 kcal/mol); respectivamente, propias de un proceso de
difusión pasiva.
Se ha caracterizado también en este traba jo la fosforilación de la
conexina-32, principal componente de las uniones comunicantes de hígado de
rata, por la proteína quinasa A y la proteína quinasa C. Además, hemos
encontrado que esta conexina se fosforila por una fracción enriquecida en
el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), purificada mediante
cromatografía de afinidad de calmodulina-agarosa a partir de membranas
plasmáticas previamente solubilizadas. Esta fosforilación tiene lugar en
residuos de tirosina, seriña y treonina. La fosforilación de la conexina-32
en residuos de tirosina fue estimulada por el EGF, sugiriendo que el
receptor del EGF cataliza dicho proceso. La m-calpaína hidroliza la
conexina-32 en su extremo carboxilo dando un fragmento mayor de 26 kDa que
contiene el (los) sitio(s) de fosforilación por el receptor del EGF.
Asimismo, hemos demostrado que la calmodulina inhibe la fosforilación en
tirosina de la conexina-32 independientemente de la presencia de calcio.
La coñexina-26 no se fosforila por la fracción enriquecida en el receptor
del EGF, mientras que la conexina-32 de hígado de ratón se fosforila por
dicha preparación pero de un modo no estimulable por el EGF. We have purified gap junctions from rat liver plasma membranes and assessed
their degree of purity and their structural organization ínto membrane
plaques. The purified gap junctions were reconstituted into liposomes, and
channel conductance was analyzed on the basis of the difussion of ascorbate
into their lumen and subsequent reduction of intraliposomal cytochrome c,
which was monitored spectrophotometrically.
Permeability through the channel was found to be a temperature dependent
process. A transition temperature of 28,2° C and activation energies of
28,8 kJ/mol {6,9 kcal/mol) and 15,6 kj/mol (3,7 kcal/mol) above and below
that temperature, respectively, were calculated from the corresponding
Arrhenius plot. These activation energies are typical of passive difussion
processes.
We have also characterized'the phosphorylation of connexin-32, the main
component of rat liver gap junctions, by protein kinase A and protein
kinase C. Also, we have found that this connexin is phosphorylated by an
epidermal growth factor {EGF) receptor-enriched fraction, purified from
solubilized rat liver plasma membranes by calmodulin affinity
chromatography. Phosphorylation of connexin-32 by the EGF receptor
preparation occurred in tyrosine, serine and threonine residues. Tyrosine
phosphorylation takes place in an EGF-stimulated manner. m-Calpain
hydrolizes phosphorylated rat liver connexin-32 in its carboxyl-terminal
tail, producing a major 26 kDa fragment which contains the phosphorylation
site(s) by the EGF receptor. Also, calmodulin inhibits connexin-32 tyrosine
phosphorylation in a calcium-independent manner.
In contrast, connexin-2 6 from mouse liver gap junctions was not
phosphorylated by the EGF receptor enriched fraction, whereas mouse
connexin-32 was phosphorylated by this fraction but not in an EGFstimulated
manner.
Files in this item
Google Scholar:Díez Iriondo, Juan Antonio
This item appears in the following Collection(s)
Related items
Showing items related by title, author, creator and subject.