Estudio molecular y funcional de los canales de calcio de las células cromafines de la médula adrenal
Author
García Palomero, EstherEntity
UAM. Departamento de BioquímicaDate
2000-07-14Subjects
Canales de calcio - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 14-07-2000Abstract
RESUMEN
Los canales de caz' dependientes de voltaje (CCDV) están formados por el ensamblaje
de varias subunidades proteicas (al, P, a&, y), siendo la al la subunidad principal, que
constituye el poro iónico y determina las propiedades farmacológicas y funcionales del canal,
mientras que la B, la a26 y la y son subunidades auxiliares, que modulan la actividad del
mismo. Se han identificado varias clases de subunidades al que codifican para los diferentes
subtipos de CCDV funcionales, cuya existencia ha sido reconocida: L al^, ale, al s , ~ I F )N,
(ale), P/Q ( ~ I AR) ,( a i ~y) T ~ I HUI,I) .
Estudios electrofisiológicos y farmacológicos han puesto de manifiesto la diversidad de
subtipos de CCDV existentes en las células cromafines de la médula adrenal (L, N y PIQ), sin
embargo, no existen datos moleculares que sustenten dicha diversidad, o si estos subtipos de
CCDV están homogéneamente distribuidos en las células adrenérgicas y noradrenérgicas. En
este trabajo, mediante la técnica de RT-PCR o la búsqueda de los fagos positivos en una
genoteca de cDNAs de células cromafines bovinas, se han obtenido tres secuencias
nucleotidicas muy homólogas a las subunidades al^, al^ y al,, de cerebro que codifican,
respectivamente, para los CCDV del subtipo L, N y PIQ. Utilizando estas secuencias como
sondas en experimentos de hibridación in situ, realizados en secciones de glándula adrenal
bovina, hemos demostrado que el mRNA de las subunidad alese expresa homogéneamente en
toda la médula. Sin embargo, las subunidades al^ y ala se expresan más abundantemente en la
región interna de la médula, donde se localizan las células noradrenérgicas. Además, utilizando
la técnica de RT-PCR y oligonucleótidos cebadores selectivos diseñado para amplificar
diferentes subunidades al y subunidades auxiliares de la célula cromafín, se han identificado
múltiples subunidades para CCDV en estas células, algunas de ellas totalmente inesperadas
( a lE,~ I G . Ha l, s y y). Estos resultados moleculares amplian, aún más si cabe, la concepción
actual sobre la diversidad de CCDV exitente en estas células y sientan las bases para
posteriores estudios biofisicos de los mismos.
Además, en este estudio, hemos investigado la posible especialización de algún subtipo
de CCDV de las células cromafines en el control de funciones no relacionadas con la secreción
(p.e. la expresión de la proteina SNAP-25). Combinando experimentos de Western blot
(midiendo la expresión de la proteina SNAP-25) con registros de ca2+ intracelular (en células
incubadas con indo-1), hemos demostrado que la despolarización con K+ produce un aumento
de expresión de la proteina, el cual es independiente de la fuente o de la ruta de entrada de caz'
a la célula, dependiendo, exclusivamente, de los niveles de [ca2+]i alcanzados. SUMMARY
Voltage-dependent caz+ channels (VDCC) are basically a multiple subunit protein
complex consisting of a pore-forming al subunit and several auxiliary subunits (P, a,/& y y
subunits). The a, subunit determines the major pharmacological and functional properties of
the channel, although auxiliary subunits modulate properties. Several classes of al subunits
have been identified and cloned from different tissues; these classes encode for functional L
(ato,s ic, al s , ~ I F N) , ( ala), PIQ ( ~ I AR) ,( ~ I Ean)d T ~ I cI a)2+ channels ubtypes.
Pharmacological and electrophysiological studies have shown the diversity of VDCC
subtypes (L, N and PIQ) in chromaffin cells from the adrenal medulla. However. there is no
molecular data to support such diversity; and it is also unknown if these channels are
homogeneously distributed in adrenergic or noradrenergic chromafin cells. In this study, by
using RT-PCR or by screening a cDNA library of bovine chromaffin cells, we have obtained
three nucleotide sequences highly homologous to the human brain a r o , a l e and alAsu bunits
encoding respectively, for the L-, N- and PIQ-subtypes of voltage-dependent Caz+ channels. In
situ hybridization studies performed in bovine adrenal gland sections, using the above
sequences as probes, reveal that whereas a , m~RN A was homogeneously distributed
throughout the adrenal medulla, a higher expression level for the ala and al,, transcripts was
found in the interna1 medullary area, where noradrenaline-containing chromaffin cells are
localized. Furthermore, using RT-PCR and a powerful set of selective primers designed to
amplify al1 possible al and auxiliary subunits which make up the ca2' channel complex in
bovine chromaffin cells, we have identified foreseable VDCC subunits; along with unexpected
subunits (alE, al^.^ , a1s and y). These molecular results extend the actual diversity of ca2+
channel subtypes in these cells and provide new bases for their further biophysical
characterization.
In addition, in this study we have investigated whether any of the caz' channel
subtypes present in chromaEn cells is specialized in the control of functions unrelated with the
immediate exocytotic event (¡.e. the expression of the protein SNAP-25). Combining western
blot experiments (measuring SNAP-25 expression) with intracellular ca2+recording (in indo-l
loaded single cells) we have shown that, upon depolarization of the cells with high K', the
amount of ca2+ entering the cell at a given time, rather than a specialized Ca2+ channel subtype
or the ca2+source, seems to be the critica1 signal to trigger the expression of SNAP-25.
Introducción
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Description
Texto de la Tesis Doctoral
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