Caracterización del remodelador de cromatina CHD6: Control de la proliferación celular y mecanismos de reclutamiento a sus genes diana

Abstract

DNA structure contains alterations or modifications that permit or block the access of components of the transcription machinery, and DNA replication, recombination and damage repair, which result in activation or silencing of specific genes. Acetylation and methylation of lysine residues of histone tails are known as the main regulators of chromatin structure. The CHD6 chromatin remodeler is conserved from yeast to human and contains two chromodomains with binding activity to histone modifications at the N-terminus and a SNF2- like ATPase domain. Its biological function is largely unknown, however it is known that exists in intranuclear sites of mRNA synthesis, that colocalizes with RNA polymerase II and moreover it is ubiquitously expressed, although mostly in the brain. In order to characterize the CHD6 biological function, HEK293T cells were CHD6- silenced by shRNA and a transcriptome analysis was made, identifying a list of 191 genes both up- and down-regulated primarily involved in processes as cell proliferation, apoptosis and downregulation of transcription. Within these genes there is a large number of transcription factors, which are mostly associated with the cell cycle. These results were validated by qRT-PCR of five genes (NEDD4, GDF15, ITM2C, SIP1 and HPRT1) and different silencers of CHD6. Moreover the presence of CHD6 in NEDD4, GDF15 and HPRT1 genes was confirmed by chromatin immunoprecipitation assays (ChIP) observing that CHD6 is recruited to both promoter and coding regions. Analysis of the promoter sequences of CHD6-regulated genes indicate that they are enriched in transcription factors binding sites motifs, which mainly belong to the E2F, EGR and SP1 families. These families of transcription factors have a clear role in cell cycle regulation. A new and uncharacterized motif was identified in at least 65% of down-regulated genes which could represent a new binding motif for transcription factors or a motif involved in the interaction of CHD6 with promoters of down-regulated genes. Since a large number of CHD6-modulated genes regulate cell proliferation, we evaluated the growth behavior of CHD6-silenced cells by FACS and BrdU pulse-chase assays and observed that CHD6 regulates cell proliferation by promoting DNA synthesis. The histone modifications recognized by CHD6 and its chromodomains is unknown, therefore we have studied their interaction with numerous combinations of modified histones using an array of commercial peptides representing modified histones. Both CHD6 and its chromodomains mainly bind to acetylated and methylated residues of histone H4, primarily to K16ac and K20me2 marks which are associated with transcriptionally active chromatin and heterochromatin. Together these data indicate that the CHD6 function as transcriptional regulator would be mediated by its interaction with both, transcription factors of the E2F, EGR and the SP1 families and with K16ac-K20me2 modifications of histone H4. Furthermore the modulation by CHD6 of genes and transcription factors involved in cell proliferation together with its role in the progression of S phase of the cycle suggest an important role of CHD6 in the development of certain diseases, such as cancer.

Existen alteraciones o modificaciones en la estructura del ADN que permiten o bloquean el acceso a diversos componentes de la maquinaria de transcripción, replicación, recombinación y reparación del daño al ADN que tienen como resultado la activación o silenciamiento de los genes. La acetilación y metilación de residuos de lisina de las colas de histonas se conocen como el principal mecanismo regulador de la estructura de la cromatina. La proteína remodeladora de cromatina CHD6, está conservada desde levaduras hasta humano y se caracteriza por tener dos cromodominios que unen modificaciones de histonas en la región N-terminal y un dominio ATPasa SNF2-like. Su función biológica es prácticamente desconocida, no obstante se sabe que se encuentra en sitios intranucleares de síntesis de mRNA, que colocaliza con la RNA polimerasa II y que su expresión es ubicua aunque mayoritaria en cerebro. Con el objetivo de caracterizar la función biológica de CHD6, en esta tesis se silenciaron células HEK293T para CHD6 mediante shRNA y se hizo un análisis de transcriptoma, identificándose una lista de 191 genes tanto up- como down-regulados que participan principalmente en procesos de proliferación celular, apoptosis y regulación negativa de la transcripción. Dentro de estos mismos genes, CHD6 parece regular una cantidad importante de factores de transcripción, los cuales en su mayoría se asocian al ciclo celular. Dichos resultados fueron validados mediante qRT-PCR de cinco genes (NEDD4, GDF15, ITM2C, SIP1 y HPRT1) y distintos silenciadores para CHD6. Además se comprobó la presencia de CHD6 en los genes NEDD4, GDF15 y HPRT1 mediante ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), observando que CHD6 se une tanto a regiones promotoras como codificantes. El análisis de los promotores de los genes regulados por CHD6 indica que los mismos poseen motivos canónicos enriquecidos de unión a factores de transcripción (TFBS), los cuales principalmente pertenecen a las familias E2F, EGR y SP1. Se ha descrito que estas familias de factores de transcripción poseen un papel claro en la regulación del ciclo celular. También se identificó en más del 65% de los genes down-regulados un motivo no caracterizado, que podría constituir un nuevo motivo de unión para factores de transcripción o bien un motivo de interacción de CHD6 con los promotores de los genes regulados. Dada la implicación de CHD6 con genes que regulan la proliferación celular, hemos evaluado el crecimiento de las células CHD6-silenciadas mediante FACS y ensayos de pulso-caza de BrdU, observando así una reducción en la proliferación celular y ralentización para entrar a la fase S en células silenciadas para CHD6. Por otra parte, puesto que se desconocen las modificaciones de histonas a las que se unen tanto CHD6 como sus cromodominios, en esta tesis se analizó su posible interacción con numerosas combinaciones de histonas modificadas mediante un array de péptidos comercial, observando que tanto CHD6 como sus cromodominios se unen a acetilaciones y metilaciones de la histona H4, principalmente K16ac y K20me2 que están asociadas tanto a cromatina transcripcionalmente activa como a heterocromatina. Todo esto indica que la función de CHD6 como regulador transcripcional, podría estar mediada por su interacción tanto a factores de transcripción de las familias E2F, EGR y SP1 como a las modificaciones K16ac-K20me2 de la histona H4. Además la modulación por CHD6 de genes y factores de transcripción involucrados en la regulación del ciclo celular junto con con su papel en la progresión de las fase S del ciclo, parece indicar su importancia en el desarrollo de ciertas enfermedades, como el cáncer