dc.contributor.advisor | Salas Falgueras, Margarita | |
dc.contributor.advisor | Muñoz Espín, Daniel | |
dc.contributor.author | Holguera López, Isabel María | |
dc.contributor.other | UAM. Departamento de Biología Molecular | es_ES |
dc.contributor.other | Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBM) | es_ES |
dc.date.accessioned | 2015-09-10T10:38:42Z | |
dc.date.available | 2015-09-10T10:38:42Z | |
dc.date.issued | 2015-07-17 | |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10486/667865 | |
dc.description | Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17-07-2015 | es_ES |
dc.description.abstract | El mecanismo de replicación iniciada con proteína terminal (TP) del bacteriófago ϕ29 ha sido
extensamente estudiado in vitro. Sin embargo, se conoce muy poco sobre la organización espacial y
temporal de la replicación de ϕ29 in vivo. En la presente Tesis se ha estudiado la localización subcelular
de los principales componentes de la maquinaria replicativa del bacteriófago ϕ29, es decir, la TP y la
DNA polimerasa viral. Tanto la TP iniciadora como la TP parental localizan en el nucleoide bacteriano
en ausencia de otros componentes virales. Por otra parte, la localización de la DNA polimerasa viral
tiene lugar a lo largo de toda la longitud celular cuando es expresada de manera individual, pero
localiza en el nucleoide bacteriano cuando es coexpresada junto con la TP. Por tanto, la expresión de
la TP determina la localización de la DNA polimerasa viral en el nucleoide bacteriano. Durante el
proceso infectivo, ambas proteínas colocalizan con el nucleoide bacteriano, siguiendo su dinámica de
segregación. En etapas intermedias del ciclo celular tanto la TP como la DNA polimerasa viral exhiben
un patrón de localización tipo helicoidal en células infectadas, patrón que depende de la proteína del
citoesqueleto tipo actina de Bacillus subtilis MreB. Además, se ha determinado que el dominio
N-terminal de la TP es el responsable de su localización en el nucleoide bacteriano, mostrando que la
presencia de este dominio es esencial para que se dé una replicación eficiente del DNA viral durante la
infección.
Trabajos anteriores determinaron que el dominio N-terminal de la TP de ϕ29 tiene capacidad
de unión a DNA in vitro. En la presente Tesis se han estudiado los residuos aminoacídicos del dominio
N-terminal de la TP implicados en su unión a DNA. Asimismo, se ha determinado que la TP de ϕ29 se
une al DNA genómico de B. subtilis in vivo, encontrándose una correlación entre la capacidad de unión a
DNA y la localización en el nucleoide bacteriano.
La resolución de la estructura cristalográfica del heterodímero formado por la DNA polimerasa
y la TP no permitió determinar la estructura del dominio N-terminal de la TP, al encontrarse desordenado
en el cristal. En la presente Tesis se ha analizado la estructura secundaria del dominio N-terminal
mediante dicroísmo circular, mostrando que tiene un alto contenido en α-hélice. Por otra parte, se ha
estudiado el papel que la unión a DNA de la TP puede tener en la replicación del DNA viral in vitro
mediante la caracterización bioquímica de TPs mutantes en residuos básicos del dominio N-terminal,
encontrándose que los mutantes defectivos en unión a DNA están afectados en diferentes etapas de este
proceso. La proteína viral de unión a DNA de doble banda p6 compensa los defectos de iniciación y
transición de estas TPs mutantes. Además, se ha determinado que el dominio N-terminal de la TP es
necesario para una unión eficiente a la DNA polimerasa, así como para la amplificación del TP-DNA in
vitro. En conjunto, estos resultados nos permiten proponer un papel del dominio N-terminal de la TP en
el reconocimiento y apertura del origen de replicación. | es_ES |
dc.description.abstract | The protein-priming mechanism of bacteriophage ϕ29 DNA replication has been extensively
studied in vitro. However, little is known about the spatial and temporal organization of the ϕ29
replication process in vivo. In this Thesis the subcellular localization of the main components of the
bacteriophage ϕ29 replicative machinery has been studied, i.e., the terminal protein (TP) and the viral
DNA polymerase. Both the primer and parental TP localize at the bacterial nucleoid in the absence of
other viral components. On the other hand, the DNA polymerase localizes along the cellular length when
it is expressed individually, but it localizes at the bacterial nucleoid when it is co-expressed together
with TP. Therefore, TP expression determines DNA polymerase localization at the bacterial nucleoid.
During infection, both proteins colocalize at the bacterial nucleoid following its segregation dynamics.
At middle stages of the cell cycle both the TP and the DNA polymerase display a helix-like localization
pattern in infected cells, this pattern depending on the Bacillus subtilis actin-like cytoskeleton protein
MreB. Furthermore, it has been determined that the TP N-terminal domain is responsible for its nucleoid
localization, being the presence of this domain essential for an efficient viral DNA replication during the
infective process.
Previous works have shown that the TP N-terminal domain possesses DNA binding capacity
in vitro. In this Thesis the TP N-terminal domain amino acidic residues involved in DNA binding have
been studied. Additionally, it has been determined that ϕ29 TP binds B. subtilis genomic DNA in vivo,
finding a correlation between DNA binding capacity and nucleoid localization.
The resolution of the crystallographic structure of the heterodimer formed by the DNA
polymerase and the TP could not solve the structure of the TP N-terminal domain, as it was disordered
in the crystal lattice. In the present work the secondary structure of the TP N-terminal domain has
been analysed by circular dichroism, showing that it has a high proportion of α-helix. Additionally, by
means of the biochemical characterisation of mutant TPs in basic residues of the N-terminal domain,
the possible role of TP DNA binding capacity in viral DNA replication in vitro has been studied. TP
mutants defective in DNA binding are affected in performing different stages of viral DNA replication.
The viral double-stranded DNA binding protein p6 overcomes the initiation and transition defects of
these mutant TPs. In addition, it has been determined that the TP N-terminal domain is necessary for an
efficient binding to the DNA polymerase as well as for TP-DNA amplification in vitro. On the whole,
these results allow us to propose a role of the TP N-terminal domain in the recognition and unwinding of
the replication origin | en_US |
dc.format.extent | 175 pag. | es_ES |
dc.format.mimetype | application/pdf | en |
dc.language.iso | spa | en |
dc.subject.other | Bacteriófagos - Genética - Tesis doctorales | es_ES |
dc.title | Estudio del dominio de unión a DNA de la proteína terminal del bacteriófago [phi]29 y su papel en la replicación del DNA viral | es_ES |
dc.type | doctoralThesis | en |
dc.subject.eciencia | Biología y Biomedicina / Biología | es_ES |
dc.rights.cc | Reconocimiento – NoComercial – SinObraDerivada | es_ES |
dc.rights.accessRights | openAccess | en |
dc.facultadUAM | Facultad de Ciencias | |