Regulación de la señalización del ácido abscísico mediada por DDA1, un nuevo adaptador de sustrato E3 ubiquitina ligasas
Author
Iniesto Sánchez, ElisaAdvisor
Rubio Muñoz, VicenteEntity
UAM. Departamento de Biología Molecular; CSIC. Centro Nacional de Biotecnología (CNB)Date
2015-11-20Subjects
Ubiquitina - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 20-11-2015Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
La ubiquitina se une covalentemente a determinadas proteínas diana mediante una cascada enzimática
que, en numerosos casos, deriva en la degradación mediada por el proteosoma 26S de la proteína marcada.
Dicha cascada enzimática (i.e. ubiquitinación) comienza con la transferencia de una molécula de ubiquitina
desde una enzima activadora de ubiquitina (E1) a una enzima conjugadora de ubiquitina (E2). Las enzimas
ligadoras de ubiquitina (E3 ligasas) reconocen específicamente a la proteína diana y la aproximan a la E2,
facilitando de esta manera la unión de la ubiquitina al sustrato. Las enzimas E3 ligasas son, por tanto, las
responsables de que el proceso de ubiquitinación ocurra de manera específica. En algunos casos las E3 ligasas
están formadas por complejos proteicos. Uno de estos complejos E3 ligasa es el denominado complejo CRL4-
CDD, el cual se encuentra conservado en eucariotas y está formado por: un núcleo proteico central formado por
CUL4 y RBX1 (que actúa como estructura de andamiaje y permite la unión con la E2), la proteína adaptadora
DDB1 (que permite la interacción con una gran diversidad de receptores de sustrato), y el módulo adaptador de
sustrato DET1-COP10-DDA1 (que permite el reconocimiento específico de las dianas). La proteína DDA1
(DET1-DDB1-Associated 1) es una proteína pequeña, altamente conservada en eucariotas y sin dominios
conocidos, cuya función al inicio de este estudio era también desconocida.
El objetivo principal de esta tesis doctoral ha sido el estudio de los mecanismos de regulación de las E3
ubiquitina-ligasas de tipo CRL4-CDD mediante la caracterización de la relación funcional entre DDA1 y los
complejos CRL4 en la planta modelo Arabidopsis thaliana.
Con este fin, se han realizado estudios sobre la funcionalidad de la proteína DDA1 de Arabidopsis que
demuestran que DDA1, formando parte del complejo proteico que contiene a COP10, DET1 y DDB1 (complejo
CDD), permite el reconocimiento específico de sustratos que serán ubiquitinados. En concreto, se ha
demostrado la interacción in vivo entre DDA1 y los receptores de la hormona ácido abscísico (ABA) de tipo
PYR/PYL/RCAR y cómo esta interacción facilita la degradación vía proteosoma del receptor PYL8. Además, de
acuerdo con estos resultados, se ha demostrado que DDA1 regula negativamente las respuestas de desarrollo
mediadas por ABA, entre las que se encuentran la inhibición de la germinación de las semillas, del desarrollo de
la plántula y del crecimiento de la raíz.
Durante la realización de esta tesis doctoral, se ha demostrado que el mecanismo regulador de DDA1
sobre los receptores de abscísico está controlado por el balance hormonal. Así, ABA y DDA1 desempeñan un
papel opuesto en la regulación de la estabilidad del receptor PYL8, previniendo y promoviendo su degradación,
respectivamente.
El mecanismo por el cual el ABA protege a PYL8 de la degradación ha sido también elucidado en este
estudio. Este mecanismo no implica la disrupción de la interacción entre PYL8 y DDA1, pero conlleva una
reducción en los niveles de poliubiquitinación del receptor. Esto se puede explicar por la desestabilización del
complejo CRL4-CDD tras el tratamiento con ABA. Mediante ensayos de coinmunoprecipitación, se ha observado
que la capacidad de asociación entre los componentes del complejo CDD (incluyendo DDA1) y CUL4 se ve
reducida en presencia de la hormona. Este fenómeno contribuye a la desensibilización de la respuesta cuando
las condiciones de estrés remiten y los niveles endógenos de ABA disminuyen en la célula. Se sabe que tras la
imbibición de las semillas los niveles de ABA disminuyen para permitir la germinación, en este punto DDA1
facilitaría la degradación rápida de los receptores de abscísico.
En conclusión, los datos presentados en este trabajo revelan que DDA1 puede actuar como receptor de
sustratos de los complejos CRL4-CDD y desvelan un nuevo mecanismo de desensibilización de la señalización
por ABA basado en el control de la estabilidad de los receptores de esta hormona, controlado por el balance
hormonal Ubiquitin is covalently linked to Lysine (Lys) residues in certain proteins by specific enzymatic cascades,
which may result in polyubiquitination and subsequent recognition by the 26S proteasome for degradation. These
cascades begin by transference of an ubiquitin moiety from an E1 ubiquitin-activating enzyme (E1) to an E2
ubiquitin-conjugating enzyme (E2). E3 ubiquitin-ligases (E3) constitute the last step in the cascade, bringing
together the E2 and the protein target that is then ubiquitinated. E3s play a key role in ubiquitination by providing
substrate specificity. Some of these E3 ligases have a multiple subunits composition. The CRL4-CDD E3
complex is conserved in higher eukaryotes, and contains: CUL4 and RBX1 (which act as a scaffold structure and
allows E2 binding), DDB1 (as an adaptor protein), and the substrate adaptor module DET1-COP10-DDA1 (for
target recognition). DDA1 is a small protein conserved in animals and plants, it does not contain any recognizable
domain, and its function was still unknown at the beginning of this work.
The aim of this thesis is to contribute to unravel the molecular mechanisms that regulate the CRL4-CDD
E3 ligases activity, through the characterization of DDA1 function in the regulation of CRL4 complexes in the
model plant Arabidopsis thaliana.
Thus, we shed light on this issue by characterizing Arabidopsis DDA1, which we show that associates
with COP10, DET1 and DDB1 (CDD complex) and is able to interact with specific target proteins, promoting its
ubiquitination. In this regard, we found that DDA1 physically binds to members of the PYR/PYL/RCAR family of
ABA receptors. Moreover, we found that DDA1 promotes proteasomal degradation of PYL8. Therefore, DDA1,
together with the CDD components, acts as a negative regulator of ABA signaling. Accordingly, DDA1 has a
negative regulatory role in the ABA-mediated inhibition of seed germination, seedling development and root
growth.
It is noteworthy that ABA and DDA1 play opposite roles in the regulation of PYL8 stability, where ABA
and DDA1 prevent and promote PYL8 degradation, respectively.
The molecular aspects underlying ABA-mediated protection of PYL8 have been unveiled in this thesis.
This mechanism does not imply disruption of the PYL8-DDA1 interaction but a decrease in PYL8
polyubiquitination rates. This can be explained by the disruption of the CRL4-CDD complex in the presence of
ABA. We have determined by CoIP experiments that the CDD and CUL4 complex association capability
decreases after ABA treatment.
Since ABA signaling is strongly dependent on the activity of PYR/PYL/RCAR receptors, an ABAdependent
protection mechanism for receptor stability would serve to reinforce and sustain ABA signaling,
particularly during the early stages of signaling. Thus, DDA1-mediated degradation of ABA receptors may
contribute to desensitizing the pathway when the stress conditions disappear and ABA levels diminish. This
regulatory mechanism might also be instrumental to impair ABA signaling during germination, since it has been
shown that ABA concentration in seeds is reduced upon imbibition.
Our results unveil a new regulatory role for CRL4 complexes, mediated by DDA1, at the initial stage of
ABA signaling, where they affect ABA receptor function, and this mechanism is also controlled by ABA itself
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