Identificación de nuevos fármacos y dianas celulares para el tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C: Caracterización de Hidroxicina y Benztropina como inhibidores de la entrada viral y del factor celular LPIN1 como factor limitante para la iniciación de la replicación del RNA viral

Abstract

Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of severe liver disease and it remains a significant health burden worldwide with an estimated 170 million people chronically infected. The hepatitis C viruses exhibit a high genetic variability. They are grouped into 7 major genotypes and more than 80 subtypes and circulate as quasiespecies within a given infected individual. Novel treatment regimens combining different direct acting antivirals (DAAs) efficiently inhibit hepatitis C virus infection. However, they have limited availability and cost considerations. Moreover, and despite promising data in clinical trials, the potential selection for HCV resistant variants may limit their efficacy when facing such a diverse constellation of virus variants in the field. Alternative or complementary approaches offering pangenotypic antiviral activity and controlling the potential expansion of drug-­‐ escape mutants are needed. The discovery or the development of new drugs targeting host factors involved in hepatitis C virus replication provide an interesting perspective for novel antiviral strategies. By acting through a complementary mechanism of action, host-­‐targeting agents (HTAs) may synergistically act with DAAs to increase the genetic barrier to resistance and develop a broad pangenotypic activity. Additionally, hepatitis C virus co-­‐opts/hijacks host lipid and lipoproteins metabolism to enhance virus multiplication. As a consequence, alterations in lipid homeostasis take place that manifest as the pathological basis for some of HCV-­‐associated maladies. Targeting of components of host lipid metabolic pathways holds promise as an effective anti-­‐HCV therapeutic strategy as it could help to revert HCV-­‐infection associated pathogenesis. In the present work we propose two different strategies to identify new antiviral candidates against hepatitis C virus infection. The first strategy is based on the identification and evaluation of new antivirals that could be effective components of combination therapies against HCV. In order to contribute to this task, we used an unbiased screening cell culture assay to interrogate a chemical library of compounds approved for clinical use in humans. This system, that reproduces the entire virus lifecycle in a miniaturized setting, enables identifying nontoxic antiviral compounds potentially targeting any aspect of the viral lifecycle, be the target viral or cellular. We identified two novel HCV antivirals, hydroxyzine and benztropine, that have a high therapeutic window in cell culture and inhibit HCV infection by different genotypes in various hepatoma cell lines at clinically achievable doses. These compounds are selective inhibitors of HCV entry in cell culture at a post-­‐adsorption step. The second strategy is based on the identification and characterization of the functional role of a potential host target gene, LPIN1, in HCV infection. In order to accomplish this aim, we downregulated LPIN1 protein expression by silencing its mRNA expression using RNAi in a human hepatoma cell line. By using surrogate models for different aspects of hepatitis C virus infection, we determined that cellular levels of LPIN1 protein are limiting for HCV infection independently of the viral genotype, at the level of initiation of HCV replication without affecting primary translation. However, LPIN1 downregulation does not interfere with persistent HCV infection. LPIN1 role on HCV replication appears to be specific, as another positive single-­‐stranded RNA virus infection, human coronavirus 229E-­‐GFP, is not limited by LPIN1 downregulation. Additionally, we observed an induction of LPIN1 mRNA and protein expression levels during HCV infection suggesting that viral infection could interfere with regulation of LPIN1 expression and hypothetically activity and consequently with cellular lipid homeostasis. These results indicate that LPIN1 is an essential host factor for HCV replication and holds promise for the development of new antivirals targeting its function to inhibit HCV infection while potentially reverting certain aspects of HCV-­‐associated pathogenesis

El virus de la hepatitis C (HCV) es la principal causa mundial de enfermedad hepática grave y representa un problema biomédico importante con cerca de 170 millones de individuos crónicamente infectados en todo el mundo. Los virus de la hepatitis C presentan una elevada variabilidad genética con 7 genotipos mayoritarios y más de 80 subtipos exhibiendo, además, una dinámica de cuasiespecies en cada paciente. Aunque existen terapias basadas en el uso combinado de agentes antivirales directos (DAAs) que inhiben eficientemente la infección por HCV, su elevado coste, una eficacia limitada a unos cuantos genotipos virales y la aparición de variantes resistentes dificultan, en muchos casos, su implantación. Nuevas estrategias terapéuticas que ofrezcan una actividad pangenotípica y ayuden a contener la expansión de mutantes resistentes son necesarias. En este sentido, la identificación o el diseño de fármacos frente a factores celulares (HTAs) con un papel esencial en el ciclo replicativo de HCV cobra especial importancia ya que, al presentar mecanismos de acción complementarios a los DAAs, éstos podrían actuar de manera sinérgica ofreciendo una barrera genética elevada al desarrollo de resistencias y cubriendo, potencialmente, un mayor número de genotipos. HCV explota diferentes componentes del metabolismo de lípidos y lipoproteínas celular para una replicación más eficiente; ello induce importantes cambios en la homeostasis lipídica de la célula que se traducen en la aparición de patologías graves. La identificación de proteínas celulares con un papel central en dicho metabolismo y la actuación sobre ellas ayudaría revertir la patogénesis asociada a la infección por HCV así como al diseño de nuevos fármacos frente a la misma. En este trabajo se presentan dos estrategias diferentes para el desarrollo de nuevas terapias antivirales frente a la infección por HCV. La primera estrategia se basa en la identificación y evaluación de nuevos antivirales que podrían emplearse en terapia combinada frente a la infección por HCV. Empleando un sistema de infección no sesgado y miniaturizado que reproduce el ciclo replicativo completo del virus y permite el análisis simultáneo de cientos de moléculas con potencial para inhibir cualquier aspecto del ciclo infectivo de HCV, ya sea su diana tanto celular como viral, identificamos dos compuestos autorizados para uso clínico, benztropina e hidroxicina, que presentan una amplia ventana terapéutica e inhiben la infección por distintos genotipos de HCV en diferentes líneas celulares de hepatoma humano. Ambos compuestos inhiben específicamente la entrada de HCV actuando en un paso posterior a la adsorción del virus a la célula hospedadora. La segunda estrategia se basa en la identificación y caracterización del papel funcional de la proteína LPIN1 en la infección por HCV. Mediante RNAi silenciamos la expresión de LPIN1 en líneas celulares de hepatoma humano empleando dos shRNAs diferentes. Usando modelos sustitutivos de diferentes aspectos de la infección con HCV comprobamos que los niveles celulares de LPIN1 son limitantes para el establecimiento y/o funcionamiento de los complejos de replicación del virus una vez traducidos los genomas entrantes y con independencia del genotipo viral considerado. No obstante, parecen dispensables en el contexto de una infección persistente. LPIN1 tiene un papel específico sobre la replicación de HCV ya que su silenciamiento no resulta limitante para la infección por otro virus RNA de cadena sencilla y polaridad positiva, como el coronavirus humano 229E-­‐GFP. Alternativamente, observamos una inducción en los niveles de RNA mensajero y proteína de LPIN1 durante la infección por HCV que sugiere que dicha infección podría interferir en la regulación de la expresión de LPIN1 y, por lo tanto, con la homeostasis de lípidos. LPIN1 se presenta así como un factor celular esencial en la replicación de HCV y plantea la posibilidad de desarrollar fármacos dirigidos frente a su función que ayudarían a inhibir la infección por HCV y revertir la patogénesis asociada a la misma