Identificación de nuevos fármacos y dianas celulares para el tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C: Caracterización de Hidroxicina y Benztropina como inhibidores de la entrada viral y del factor celular LPIN1 como factor limitante para la iniciación de la replicación del RNA viral
Author
Mingorance Pérez, LidiaAdvisor
Gastaminza Landart, PabloEntity
UAM. Departamento de Biología Molecular; CSIC. Centro Nacional de Biotecnología (CNB)Date
2015-11-13Funded by
El trabajo presentado en esta Tesis Doctoral ha sido financiado por una beca Predoctoral JAE-Predoc del Consejo Superior de Investigaciones CientíficasSubjects
Virus de la hepatitis C - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 13-11-2015
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
Hepatitis
C
virus
(HCV)
is
a
major
cause
of
severe
liver
disease
and
it
remains
a
significant
health
burden
worldwide
with
an
estimated
170
million
people
chronically
infected.
The
hepatitis
C
viruses
exhibit
a
high
genetic
variability.
They
are
grouped
into
7
major
genotypes
and
more
than
80
subtypes
and
circulate
as
quasiespecies
within
a
given
infected
individual.
Novel
treatment
regimens
combining
different
direct
acting
antivirals
(DAAs)
efficiently
inhibit
hepatitis
C
virus
infection.
However,
they
have
limited
availability
and
cost
considerations.
Moreover,
and
despite
promising
data
in
clinical
trials,
the
potential
selection
for
HCV
resistant
variants
may
limit
their
efficacy
when
facing
such
a
diverse
constellation
of
virus
variants
in
the
field.
Alternative
or
complementary
approaches
offering
pangenotypic
antiviral
activity
and
controlling
the
potential
expansion
of
drug-‐
escape
mutants
are
needed.
The
discovery
or
the
development
of
new
drugs
targeting
host
factors
involved
in
hepatitis
C
virus
replication
provide
an
interesting
perspective
for
novel
antiviral
strategies.
By
acting
through
a
complementary
mechanism
of
action,
host-‐targeting
agents
(HTAs)
may
synergistically
act
with
DAAs
to
increase
the
genetic
barrier
to
resistance
and
develop
a
broad
pangenotypic
activity.
Additionally,
hepatitis
C
virus
co-‐opts/hijacks
host
lipid
and
lipoproteins
metabolism
to
enhance
virus
multiplication.
As
a
consequence,
alterations
in
lipid
homeostasis
take
place
that
manifest
as
the
pathological
basis
for
some
of
HCV-‐associated
maladies.
Targeting
of
components
of
host
lipid
metabolic
pathways
holds
promise
as
an
effective
anti-‐HCV
therapeutic
strategy
as
it
could
help
to
revert
HCV-‐infection
associated
pathogenesis.
In
the
present
work
we
propose
two
different
strategies
to
identify
new
antiviral
candidates
against
hepatitis
C
virus
infection.
The
first
strategy
is
based
on
the
identification
and
evaluation
of
new
antivirals
that
could
be
effective
components
of
combination
therapies
against
HCV.
In
order
to
contribute
to
this
task,
we
used
an
unbiased
screening
cell
culture
assay
to
interrogate
a
chemical
library
of
compounds
approved
for
clinical
use
in
humans.
This
system,
that
reproduces
the
entire
virus
lifecycle
in
a
miniaturized
setting,
enables
identifying
nontoxic
antiviral
compounds
potentially
targeting
any
aspect
of
the
viral
lifecycle,
be
the
target
viral
or
cellular.
We
identified
two
novel
HCV
antivirals,
hydroxyzine
and
benztropine,
that
have
a
high
therapeutic
window
in
cell
culture
and
inhibit
HCV
infection
by
different
genotypes
in
various
hepatoma
cell
lines
at
clinically
achievable
doses.
These
compounds
are
selective
inhibitors
of
HCV
entry
in
cell
culture
at
a
post-‐adsorption
step.
The
second
strategy
is
based
on
the
identification
and
characterization
of
the
functional
role
of
a
potential
host
target
gene,
LPIN1,
in
HCV
infection.
In
order
to
accomplish
this
aim,
we
downregulated
LPIN1
protein
expression
by
silencing
its
mRNA
expression
using
RNAi
in
a
human
hepatoma
cell
line.
By
using
surrogate
models
for
different
aspects
of
hepatitis
C
virus
infection,
we
determined
that
cellular
levels
of
LPIN1
protein
are
limiting
for
HCV
infection
independently
of
the
viral
genotype,
at
the
level
of
initiation
of
HCV
replication
without
affecting
primary
translation.
However,
LPIN1
downregulation
does
not
interfere
with
persistent
HCV
infection.
LPIN1
role
on
HCV
replication
appears
to
be
specific,
as
another
positive
single-‐stranded
RNA
virus
infection,
human
coronavirus
229E-‐GFP,
is
not
limited
by
LPIN1
downregulation.
Additionally,
we
observed
an
induction
of
LPIN1
mRNA
and
protein
expression
levels
during
HCV
infection
suggesting
that
viral
infection
could
interfere
with
regulation
of
LPIN1
expression
and
hypothetically
activity
and
consequently
with
cellular
lipid
homeostasis.
These
results
indicate
that
LPIN1
is
an
essential
host
factor
for
HCV
replication
and
holds
promise
for
the
development
of
new
antivirals
targeting
its
function
to
inhibit
HCV
infection
while
potentially
reverting
certain
aspects
of
HCV-‐associated
pathogenesis El
virus
de
la
hepatitis
C
(HCV)
es
la
principal
causa
mundial
de
enfermedad
hepática
grave
y
representa
un
problema
biomédico
importante
con
cerca
de
170
millones
de
individuos
crónicamente
infectados
en
todo
el
mundo.
Los
virus
de
la
hepatitis
C
presentan
una
elevada
variabilidad
genética
con
7
genotipos
mayoritarios
y
más
de
80
subtipos
exhibiendo,
además,
una
dinámica
de
cuasiespecies
en
cada
paciente.
Aunque
existen
terapias
basadas
en
el
uso
combinado
de
agentes
antivirales
directos
(DAAs)
que
inhiben
eficientemente
la
infección
por
HCV,
su
elevado
coste,
una
eficacia
limitada
a
unos
cuantos
genotipos
virales
y
la
aparición
de
variantes
resistentes
dificultan,
en
muchos
casos,
su
implantación.
Nuevas
estrategias
terapéuticas
que
ofrezcan
una
actividad
pangenotípica
y
ayuden
a
contener
la
expansión
de
mutantes
resistentes
son
necesarias.
En
este
sentido,
la
identificación
o
el
diseño
de
fármacos
frente
a
factores
celulares
(HTAs)
con
un
papel
esencial
en
el
ciclo
replicativo
de
HCV
cobra
especial
importancia
ya
que,
al
presentar
mecanismos
de
acción
complementarios
a
los
DAAs,
éstos
podrían
actuar
de
manera
sinérgica
ofreciendo
una
barrera
genética
elevada
al
desarrollo
de
resistencias
y
cubriendo,
potencialmente,
un
mayor
número
de
genotipos.
HCV
explota
diferentes
componentes
del
metabolismo
de
lípidos
y
lipoproteínas
celular
para
una
replicación
más
eficiente;
ello
induce
importantes
cambios
en
la
homeostasis
lipídica
de
la
célula
que
se
traducen
en
la
aparición
de
patologías
graves.
La
identificación
de
proteínas
celulares
con
un
papel
central
en
dicho
metabolismo
y
la
actuación
sobre
ellas
ayudaría
revertir
la
patogénesis
asociada
a
la
infección
por
HCV
así
como
al
diseño
de
nuevos
fármacos
frente
a
la
misma.
En
este
trabajo
se
presentan
dos
estrategias
diferentes
para
el
desarrollo
de
nuevas
terapias
antivirales
frente
a
la
infección
por
HCV.
La
primera
estrategia
se
basa
en
la
identificación
y
evaluación
de
nuevos
antivirales
que
podrían
emplearse
en
terapia
combinada
frente
a
la
infección
por
HCV.
Empleando
un
sistema
de
infección
no
sesgado
y
miniaturizado
que
reproduce
el
ciclo
replicativo
completo
del
virus
y
permite
el
análisis
simultáneo
de
cientos
de
moléculas
con
potencial
para
inhibir
cualquier
aspecto
del
ciclo
infectivo
de
HCV,
ya
sea
su
diana
tanto
celular
como
viral,
identificamos
dos
compuestos
autorizados
para
uso
clínico,
benztropina
e
hidroxicina,
que
presentan
una
amplia
ventana
terapéutica
e
inhiben
la
infección
por
distintos
genotipos
de
HCV
en
diferentes
líneas
celulares
de
hepatoma
humano.
Ambos
compuestos
inhiben
específicamente
la
entrada
de
HCV
actuando
en
un
paso
posterior
a
la
adsorción
del
virus
a
la
célula
hospedadora.
La
segunda
estrategia
se
basa
en
la
identificación
y
caracterización
del
papel
funcional
de
la
proteína
LPIN1
en
la
infección
por
HCV.
Mediante
RNAi
silenciamos
la
expresión
de
LPIN1
en
líneas
celulares
de
hepatoma
humano
empleando
dos
shRNAs
diferentes.
Usando
modelos
sustitutivos
de
diferentes
aspectos
de
la
infección
con
HCV
comprobamos
que
los
niveles
celulares
de
LPIN1
son
limitantes
para
el
establecimiento
y/o
funcionamiento
de
los
complejos
de
replicación
del
virus
una
vez
traducidos
los
genomas
entrantes
y
con
independencia
del
genotipo
viral
considerado.
No
obstante,
parecen
dispensables
en
el
contexto
de
una
infección
persistente.
LPIN1
tiene
un
papel
específico
sobre
la
replicación
de
HCV
ya
que
su
silenciamiento
no
resulta
limitante
para
la
infección
por
otro
virus
RNA
de
cadena
sencilla
y
polaridad
positiva,
como
el
coronavirus
humano
229E-‐GFP.
Alternativamente,
observamos
una
inducción
en
los
niveles
de
RNA
mensajero
y
proteína
de
LPIN1
durante
la
infección
por
HCV
que
sugiere
que
dicha
infección
podría
interferir
en
la
regulación
de
la
expresión
de
LPIN1
y,
por
lo
tanto,
con
la
homeostasis
de
lípidos.
LPIN1
se
presenta
así
como
un
factor
celular
esencial
en
la
replicación
de
HCV
y
plantea
la
posibilidad
de
desarrollar
fármacos
dirigidos
frente
a
su
función
que
ayudarían
a
inhibir
la
infección
por
HCV
y
revertir
la
patogénesis
asociada
a
la
misma
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