Caracterización del papel de WIP en morfogénesis neuronal

Abstract

The great complexity of the nervous system is sustained by the highly polarized morphology of neurons. For this reason it is important that neuritogenesis occurs at the right place and at the right moment in order to establish correct connections with proper targets. Several environmental cues converge on intracellular events, as signaling transduction, exocytic and endocytic mechanisms and cytoskeletal rearrangements, to modulate neuritogenesis. Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP)-interacting protein (WIP), is an actin-binding protein involved in the regulation of actin polymerization in cells such as fibroblasts and lymphocytes. In spite of its recognized function in non-neuronal cells, the role of WIP in the central nervous system has never been examined before. We used WIP-deficient mice to analyze the function of WIP in neurons using imaging techniques and gain-of-function and loss-of-function in vitro studies and in utero electroporation as in vivo approach. Herein we describe the expression of WIP in embryonic and adult murine neural cells. In this thesis work we report that WIP-/- differentiating primary hippocampal neurons exhibit enlargement of somas, and overgrowth of neuritic and dendritic branches that are more evident in early developmental stages. WIP deficiency also increases the amplitude and the frequency of miniature excitatory postsynaptic currents, suggesting that WIP-/- neurons contain more mature synapses than WT neurons. Our data describe that loss of WIP in primary neurons alters the subcellular distribution of actin nucleation promoting factors with WIP-binding capacity, such as N-WASP and cortactin. Inhibition of N-WASP activity by wiskostatin treatment approaches the phenotype of WIP-/- immature neurons to that of control cells, supporting the contribution of WIP to the regulation of N-WASP activity in neuritogenesis. Our results demonstrate an essential role for the cooperative action of WIP-cortactin-N-WASP to control neuronal morphogenesis and the adequate formation of neuronal networks. Moreover, in this work we show that the increased neuritic branching and soma area described in WIP-/- immature primary neurons correlate with a significative reduction in the mTORC1/p70S6K pathway activity. Blocking mTORC1 kinase activity with rapamycin at early stages of neuronal differentiation induces neuritic branching overgrowth and soma enlargement in WT neurons. The absence of WIP also associates with a enhancement of the PI3K/Akt/mTORC1 pathway in E17 murine cortex. In summary, these findings reveal WIP as a new negative regulator of neuronal and synaptic maturation.

La enorme complejidad del sistema nervioso depende en gran parte de la polaridad morfológica de las neuronas. Por este motivo, es importante que la neuritogénesis se inicie en el lugar y momento adecuados para poder establecer conexiones adecuadas con las dianas correctas. Diferentes señales extracelulares modulan la neuritogénesis a través de eventos intracelulares como transducción de señales, exocitosis y endocitosis y reorganización del citoesqueleto. WIP, la proteína que interacciona con la proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich (WASP), une actina y está implicada en la regulación de la polimerización localizada de actina en células como fibroblastos y linfocitos. Aunque se han descrito sus funciones en células no neuronales, el papel de WIP en el sistema nervioso central nunca se ha examinado. En este trabajo de tesis empleamos ratones deficientes en WIP para analizar la función de WIP en neuronas mediante técnicas de imagen, ensayos in vitro de ganancia y de pérdida de función así como electroporación in utero como aproximación in vivo. Describimos la expresión de WIP en células neurales murinas embrionarias y adultas e indicamos que las neuronas primarias de hipocampo WIP-/- en diferenciación presentan un aumento en el área del soma además de ramificaciones neuríticas y dendríticas prematuras que son más evidentes en estadios tempranos de desarrollo. La deficiencia de WIP también incrementa la amplitud y la frecuencia de corrientes excitatorias postsinápticas miniatura, lo que sugiere que las neuronas WIP- /- elaboran sinapsis más maduras que las neuronas control. Nuestros datos describen que la pérdida de WIP en neuronas primarias altera la distribución subcelular de factores promotores de la nucleación de actina con capacidad de unión a WIP, como N-WASP y cortactina. La inhibición de la actividad de N-WASP con wiskostatina aproxima el fenotipo de las neuronas WIP-/- inmaduras al de las células control, reforzando la contribución de WIP a la regulación de la actividad de N-WASP en neuritogénesis. Nuestros resultados demuestran el papel esencial de la acción cooperativa de WIP-cortactina-N-WASP en el control de la morfogénesis neuronal y la formación de redes neuronales. Además, en este trabajo mostramos que el incremento en la ramificación neurítica y en el tamaño del soma descrito en neuronas primarias WIP-/- inmaduras correlaciona con una reducción significativa en la actividad de la vía mTORC1/p70S6K. El bloqueo de la actividad quinasa de mTORC1 con rapamicina en estadios tempranos de la diferenciación neuronal incrementa la ramificación neurítica y el área del soma en neuronas control. La ausencia de WIP también se asocia con una potenciación de la vía PI3K/Akt/mTORC1 en corteza E17. En resumen, estos resultados presentan a WIP como un nuevo regulador negativo de la maduración neuronal y sináptica.