The role of the Crc/Hfq/CrcZ-CrcY global regulatory system on the regulation of metabolic and cellular processes in Pseudomonas putida

Abstract

Metabolically versatile bacteria have evolved diverse strategies to adapt and to colonize different environments and niches. This ensures high fitness and the ability to withstand changing surrounding conditions and diverse kinds of stresses. These abilities rely on a varied genetic repertoire and on complex regulatory networks that integrate external and internal signals, providing efficient responses. Pseudomonas putida possesses a large genome and a remarkable metabolic and physiologic versatility, with several regulatory networks that assure metabolic responses for surviving in a wide variety of environments. One of the main regulatory networks that serve to optimize metabolism, growth speed and cellular fitness is the so-called Carbon Catabolite Repression (CCR). This regulatory mechanism ensures that, when mixtures of carbon sources are available at sufficient concentrations, those with higher energetic yield are preferentially assimilated, limiting the use of those that are less preferred. This process allows a hierarchical and sequential assimilation of the carbon sources available, optimizing metabolism and the overall fitness. In P. putida, the Crc and Hfq proteins and the CrcZ and CrcY small RNAs are key components of CCR. The Crc and Hfq proteins work together to inhibit the translation of some mRNAs that present an A-rich sequence, named CA motif, located close to the ribosome binding site. In turn, Crc/Hfq action is antagonised by the CrcZ and CrcY sRNAs. The levels of these two sRNAs are low in media that generate high CCR conditions and increase significantly when CCR decreases; it is believed that the function of these sRNAs is to bind the Hfq protein, perhaps together with Crc, sequestering them when their effects are not necessary. The work described in this thesis expands our knowledge on the influence of CCR, and in particular of the Crc/Hfq/CrcZ-CrcY system, in shaping P. putida metabolism according to environmental conditions. The results presented illustrate the role of the Crc regulator in controlling several metabolic processes. We have determined the hierarchy of assimilation of organic acids and amino acids when cells grow in a complex medium, where CCR is strong, and the role of the Crc protein in regulating this process. We have also clarified the influence of the Crc regulator in balancing the carbon fluxes through central metabolic pathways under mild CCR conditions, optimizing metabolism. Moreover, we have shown that the Crc/Hfq/CrcZCrcY regulatory network can modulate the synthesis of polyhydroxyalkanoates, which are important storage compounds, thus balancing carbon flow. The influence of the Crc protein in the synthesis of polyhydroxyalkanoates extends the role of this regulator beyond that of repressing the uptake and assimilation of non-preferred carbon sources

Las bacterias que tienen un metabolismo versátil han desarrollado diversas estrategias para adaptarse a diferentes ambientes, y colonizarlos. Entre ellas destaca la capacidad de resistir condiciones ambientales cambiantes y diversos tipos de estrés, características que confieren una elevada eficacia biológica. Pseudomonas putida tiene una gran versatilidad metabólica y fisiológica, características que derivan de un genoma grande cuya expresión está controlada por diversas redes de regulación global que aseguran respuestas adecuadas frente a señales fisiológicas y del medio ambiente. Esto facilita su supervivencia en condiciones y ecosistemas muy variados. Una de las redes de regulación más importantes para optimizar el metabolismo, la velocidad de crecimiento y la eficacia biológica es la llamada represión catabólica. Este mecanismo regulador asegura que, cuando las células disponen de diversas fuentes de carbono en concentraciones suficientes, se metabolicen preferentemente aquellas que facilitan un mejor rendimiento energético, limitando el uso de otros compuestos menos preferidos. Este proceso regulador permite una asimilación secuencial y jerárquica de las fuentes de carbono disponibles, optimizando el metabolismo y la capacidad competitiva de la bacteria. En P. putida, las proteínas Crc y Hfq, y los RNAs pequeños CrcZ y CrcY, son componentes clave de la represión catabólica. Crc y Hfq trabajan juntas para inhibir la traducción de determinados mRNAs que tienen una secuencia rica en adeninas (llamada motivo CA) en la región de inicio de la traducción. Los RNAs pequeños CrcZ y CrcY regulan la acción de Crc y Hfq, actuando como antagonistas. Los niveles de estos dos RNAs son bajos en situaciones que generan una fuerte represión catabólica, pero aumentan significativamente cuando la represión disminuye. Se piensa que la función de CrcZ y CrcY es unir la proteína Hfq, quizá junto con Crc, secuestrándolas cuando su efecto no es necesario. El trabajo que se describe en esta tesis aporta información nueva sobre la influencia de la represión catabólica, y en particular del sistema Crc/Hfq/CrcZ-CrcY, en la adaptación del metabolismo de P. putida a condiciones ambientales cambiantes. Los resultados obtenidos ilustran la función de la proteína reguladora Crc en el control de varios procesos metabólicos. Hemos analizado la jerarquía de asimilación de diversos ácidos orgánicos y aminoácidos cuando la célula crece en un medio rico, en el que la represión catabólica es muy fuerte, y la función de Crc en este proceso. También hemos clarificado la influencia del regulador Crc en el balance de los flujos de metabolitos a través de las rutas metabólicas centrales, optimizando el metabolismo cuando las células crecen en condiciones en las que la represión catabólica es moderada. Además, mostramos que el sistema regulador Crc/Hfq/CrcZ-CrcY puede modular la síntesis de polihidroxialcanoatos, que son compuestos de reserva importantes. En conjunto, los resultados implican que este sistema regulador no solo controla el transporte y asimilación de fuentes de carbono, sino que influye en todo el proceso del flujo de compuestos carbonados