Gene editing in hematopoietic stem cells: A potential therapeutic approach for Fanconi anemia
Author
Díez Cabezas, BegoñaEntity
UAM. Departamento de Biología; Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas (CIEMAT); Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER); Instituto de Investigación Sanitaria Fundación Jiménez Díaz (IIS-FJD)Date
2015-12-14Funded by
Para su ejecución, el trabajo de investigación realizado ha contado con la colaboración de los siguientes Programas de Investigación: · Séptimo Programa Marco de la Comisión Europea (Proyecto PERSIST; Ref 222878). · Ministerio de Economía y Competitividad (Proyectos SAF 2012-39834). · Fondo de Investigaciones Sanitarias, Instituto de Salud Carlos III (RETICSRD06/ 0010/0015; RD12/0019/0023). · Dirección General de Investigación de la Comunidad de Madrid (Proyecto CellCAM; Ref S2012/BMD-2420). · Programa de transferencia de tecnología en el campo de la terapia génica de la Fundación Botín. Begoña Díez Cabezas ha disfrutado de una beca de Formación del Profesorado Universitario (FPU) del Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (Ref AP2009-4413) y de un contrato del IIS-FJDSubjects
Terapia génica - Tesis doctorales; Enfermedades raras - Tratamiento - Tesis doctorales; Células madre hematopoyéticas - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología. Fecha de lectura: 14-12-2015
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
La terapia génica constituye hoy en día una alternativa segura y eficaz para el tratamiento de
determinadas enfermedades monogénicas que afectan al sistema hematopoyético. Sin
embargo, puesto que el riesgo de mutagénesis insercional debido al uso de vectores
integrativos no se puede descartar completamente, la terapia génica de edición se ha
propuesto como una alternativa más segura, ya que la inserción del gen terapéutico está
dirigida a un locus específico del genoma. Las aproximaciones de edición génica se basan en el
uso de nucleasas específicas que generan roturas de doble cadena en un sitio específico del
genoma, mejorando así la eficacia de la recombinación homóloga con construcciones
donadoras que albergan el gen de interés flanqueado por los brazos de homología
correspondientes. En este estudio se han optimizado las condiciones para editar líneas
celulares linfoblastoides (LCLs) y células madre hematopoyéticas (CMHs), inicialmente de
donantes sanos, con el objetivo final de corregir mediante terapia génica de edición las
progenitores hematopoyéticos de pacientes con anemia de Fanconi del subtipo A (AF-A).
En particular, hemos establecido un método eficaz para editar LCLs y CMHs en un sitio seguro
en el genoma, el locus AAVS1. Nuestro protocolo se basa en la transducción de estas células
con vectores lentivirales defectivos en integración que portan un donador con el gen de
interés, seguido de la nucleofección de estas células con nucleasas de dedos de zinc (ZFNs)
utilizadas como ARNm. Utilizando un vector donador control que lleva el gen marcador GFP
hemos logrado una eficiencia media de corrección génica dirigida en células CD34+ de
donantes sanos del 9,43%. Por otra parte, hemos confirmado que la edición génica también es
eficaz en CMHs multipotentes con capacidad de repoblación a largo plazo en ratones
inmunodeficientes. Para mejorar la eficacia de la edición génica, hemos investigado la
posibilidad de utilizar nanopartículas de oro, que incrementaron la eficiencia de transducción
de vectores lentivirales integrativos y no integrativos en las células CD34+. Sin embargo, este
incremento no dio lugar a una mejora en la edición génica, debido a la toxicidad asociada a la
nucleofección de las células tratadas con las nanopartículas. A continuación, mediante el uso
de un vector donador terapéutico, portador del gen FANCA, hemos demostrado la corrección
del fenotipo de LCLs de pacientes con AF-A mediante edición génica, que confirmamos por la
formación de focos de reparación de FANCD2 y la reversión de la sensibilidad de estas células
frente a un agente entrecruzante del ADN, tal como mitomicina C (MMC). Para mejorar la
eficacia de edición génica en células hematopoyéticas de pacientes AF-A, también
investigamos el efecto mediado por la inhibición transitoria de la anti-recombinasa PARI.
Aunque la inhibición de PARI aumentó los focos de reparación de RAD51, no observamos
aumento significativo en la eficiencia de la edición génica. Por último, hemos demostrado que
nuestro protocolo de edición génica también permite, aunque con menor eficacia, la inserción
del gen terapéutico en progenitores hematopoyéticos de pacientes con AF-A, permitiendo así
la reversión parcial de su sensibilidad a MMC.
Nuestro estudio demuestra por primera vez que la terapia génica de edición en el locus seguro
AAVS1 es factible en las células hematopoyéticas, incluyendo progenitores hematopoyéticos
primarios, de pacientes con anemia de Fanconi del subtipo A, abriendo nuevas perspectivas
para la terapia génica dirigida de esta enfermedad, así como de otras enfermedades
monogénicas del sistema hematopoyético Gene therapy nowadays constitutes a safe and efficient treatment for a number of monogenic
diseases affecting the hematopoietic system. Risks of insertional mutagenesis derived from the
use of integrative vectors cannot, however, be completely excluded. Therefore, gene targeting
has been proposed as a safer alternative, since the insertion of the therapeutic gene is driven
to a specific locus in the genome. Gene targeting approaches are based on the use of specific
nucleases which generate double strand breaks (DSBs) in a specific site of the genome,
markedly enhancing the efficacy of homologous recombination (HR) with donor constructs
harboring the gene of interest flanked by the corresponding homology arms. In this study we
have optimized the conditions to target human lymphoblastic cell lines (LCLs) and also
hematopoietic stem cells (HSCs) from healthy donors, with the final aim of correcting by gene
editing the hematopoietic progenitor cells from Fanconi anemia subtype A (FA-A) patients.
In particular, we have established a robust method to target both LCLs and HSCs in a safe
harbor site in the genome, the AAVS1 locus. Our approach is based on the transduction of
these cells with integrase-defective lentiviral vectors carrying a donor with the gene of
interest, followed by the nucleofection of these cells with zinc finger nucleases used as mRNA.
Using a control donor vector carrying the GFP reporter gene we have obtained, on average,
9.43% gene targeting efficiency in cord blood CD34+ cells from healthy donors. Moreover, we
confirmed that gene targeting was also efficient in HSCs with long term and multipotent
repopulation capacity, as demonstrated by transplants into immunodeficient mice. To improve
the gene targeting efficiency, we investigated the feasibility of using gold nanoparticles, which
were shown to improve the transduction efficiency of integrase-defective and competent
lentiviral vectors in HSCs. This increment, however, did not lead to a higher gene targeting
efficiency, due to the toxicity associated with the nucleofection of cells treated with these
nanoparticles. In our next step, we moved from healthy donor HSCs to FA hematopoietic cells.
Using a therapeutic donor vector carrying the FANCA gene, we demonstrated that gene
targeting can correct the phenotype in a FA-A LCL. This was deduced from the restoration of
FANCD2 foci formation and the reversion of the sensitivity of FA-A cells to interstrand cross
linkers, such as mitomycin C (MMC). To improve the gene targeting efficiency in FA-A
hematopoietic cells, we also investigated the effects mediated by the transient inhibition of
anti-recombinase PARI. Although the inhibition of PARI increased RAD51 foci, no significant
increase of homology directed repair efficiency was observed. In a final set of experiments we
demonstrated that our gene targeting approach has also taken place in hematopoietic
progenitor cells from FA-A patients, leading to a partial reversion in their hyper-sensitivity to
MMC.
Our study demonstrates for the first time that gene targeting in the AAVS1 safe harbor locus is
feasible in hematopoietic cells from Fanconi anemia-A patients, opening up new perspectives
for the future gene therapy of this and other monogenic diseases of the hematopoietic system
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