Gene editing in hematopoietic stem cells: A potential therapeutic approach for Fanconi anemia

Abstract

La terapia génica constituye hoy en día una alternativa segura y eficaz para el tratamiento de determinadas enfermedades monogénicas que afectan al sistema hematopoyético. Sin embargo, puesto que el riesgo de mutagénesis insercional debido al uso de vectores integrativos no se puede descartar completamente, la terapia génica de edición se ha propuesto como una alternativa más segura, ya que la inserción del gen terapéutico está dirigida a un locus específico del genoma. Las aproximaciones de edición génica se basan en el uso de nucleasas específicas que generan roturas de doble cadena en un sitio específico del genoma, mejorando así la eficacia de la recombinación homóloga con construcciones donadoras que albergan el gen de interés flanqueado por los brazos de homología correspondientes. En este estudio se han optimizado las condiciones para editar líneas celulares linfoblastoides (LCLs) y células madre hematopoyéticas (CMHs), inicialmente de donantes sanos, con el objetivo final de corregir mediante terapia génica de edición las progenitores hematopoyéticos de pacientes con anemia de Fanconi del subtipo A (AF-A). En particular, hemos establecido un método eficaz para editar LCLs y CMHs en un sitio seguro en el genoma, el locus AAVS1. Nuestro protocolo se basa en la transducción de estas células con vectores lentivirales defectivos en integración que portan un donador con el gen de interés, seguido de la nucleofección de estas células con nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) utilizadas como ARNm. Utilizando un vector donador control que lleva el gen marcador GFP hemos logrado una eficiencia media de corrección génica dirigida en células CD34+ de donantes sanos del 9,43%. Por otra parte, hemos confirmado que la edición génica también es eficaz en CMHs multipotentes con capacidad de repoblación a largo plazo en ratones inmunodeficientes. Para mejorar la eficacia de la edición génica, hemos investigado la posibilidad de utilizar nanopartículas de oro, que incrementaron la eficiencia de transducción de vectores lentivirales integrativos y no integrativos en las células CD34+. Sin embargo, este incremento no dio lugar a una mejora en la edición génica, debido a la toxicidad asociada a la nucleofección de las células tratadas con las nanopartículas. A continuación, mediante el uso de un vector donador terapéutico, portador del gen FANCA, hemos demostrado la corrección del fenotipo de LCLs de pacientes con AF-A mediante edición génica, que confirmamos por la formación de focos de reparación de FANCD2 y la reversión de la sensibilidad de estas células frente a un agente entrecruzante del ADN, tal como mitomicina C (MMC). Para mejorar la eficacia de edición génica en células hematopoyéticas de pacientes AF-A, también investigamos el efecto mediado por la inhibición transitoria de la anti-recombinasa PARI. Aunque la inhibición de PARI aumentó los focos de reparación de RAD51, no observamos aumento significativo en la eficiencia de la edición génica. Por último, hemos demostrado que nuestro protocolo de edición génica también permite, aunque con menor eficacia, la inserción del gen terapéutico en progenitores hematopoyéticos de pacientes con AF-A, permitiendo así la reversión parcial de su sensibilidad a MMC. Nuestro estudio demuestra por primera vez que la terapia génica de edición en el locus seguro AAVS1 es factible en las células hematopoyéticas, incluyendo progenitores hematopoyéticos primarios, de pacientes con anemia de Fanconi del subtipo A, abriendo nuevas perspectivas para la terapia génica dirigida de esta enfermedad, así como de otras enfermedades monogénicas del sistema hematopoyético

Gene therapy nowadays constitutes a safe and efficient treatment for a number of monogenic diseases affecting the hematopoietic system. Risks of insertional mutagenesis derived from the use of integrative vectors cannot, however, be completely excluded. Therefore, gene targeting has been proposed as a safer alternative, since the insertion of the therapeutic gene is driven to a specific locus in the genome. Gene targeting approaches are based on the use of specific nucleases which generate double strand breaks (DSBs) in a specific site of the genome, markedly enhancing the efficacy of homologous recombination (HR) with donor constructs harboring the gene of interest flanked by the corresponding homology arms. In this study we have optimized the conditions to target human lymphoblastic cell lines (LCLs) and also hematopoietic stem cells (HSCs) from healthy donors, with the final aim of correcting by gene editing the hematopoietic progenitor cells from Fanconi anemia subtype A (FA-A) patients. In particular, we have established a robust method to target both LCLs and HSCs in a safe harbor site in the genome, the AAVS1 locus. Our approach is based on the transduction of these cells with integrase-defective lentiviral vectors carrying a donor with the gene of interest, followed by the nucleofection of these cells with zinc finger nucleases used as mRNA. Using a control donor vector carrying the GFP reporter gene we have obtained, on average, 9.43% gene targeting efficiency in cord blood CD34+ cells from healthy donors. Moreover, we confirmed that gene targeting was also efficient in HSCs with long term and multipotent repopulation capacity, as demonstrated by transplants into immunodeficient mice. To improve the gene targeting efficiency, we investigated the feasibility of using gold nanoparticles, which were shown to improve the transduction efficiency of integrase-defective and competent lentiviral vectors in HSCs. This increment, however, did not lead to a higher gene targeting efficiency, due to the toxicity associated with the nucleofection of cells treated with these nanoparticles. In our next step, we moved from healthy donor HSCs to FA hematopoietic cells. Using a therapeutic donor vector carrying the FANCA gene, we demonstrated that gene targeting can correct the phenotype in a FA-A LCL. This was deduced from the restoration of FANCD2 foci formation and the reversion of the sensitivity of FA-A cells to interstrand cross linkers, such as mitomycin C (MMC). To improve the gene targeting efficiency in FA-A hematopoietic cells, we also investigated the effects mediated by the transient inhibition of anti-recombinase PARI. Although the inhibition of PARI increased RAD51 foci, no significant increase of homology directed repair efficiency was observed. In a final set of experiments we demonstrated that our gene targeting approach has also taken place in hematopoietic progenitor cells from FA-A patients, leading to a partial reversion in their hyper-sensitivity to MMC. Our study demonstrates for the first time that gene targeting in the AAVS1 safe harbor locus is feasible in hematopoietic cells from Fanconi anemia-A patients, opening up new perspectives for the future gene therapy of this and other monogenic diseases of the hematopoietic system