Análisis de dominios funcionales del transportador ABC de "Saccharomyces cerevisiae", Ycf1p, mediante mutagénesis dirigida y supresión intragénica

Abstract

La proteína vacuolar Ycflp (Yeast Cadmium Factor) está implicada en la resistencia a CdZ+y a otras sustancias tóxicas que son conjugadas con glutation en Saccharoinyces cerevisiae. Pertenece a la familia de transportadores ABC (ATP Binding Cassette) que incluye proteínas humanas como CFTR (Cystic Fibrosis Conductance Transmembrane Regulator) y MRPl (Multidrug Resistance-associated Protein). El objetivo de este trabajo ha sido profundizar en el estudio de las relaciones estructurales y funcionales de la proteína Ycflp. En una primera aproximación se crearon mediante mutagénesis dirigida veintidós mutaciones únicas en residuos conservados de los dominios de unión a nucleótido (NBDl y NBD2), transmembrana (TMD2) y regulador (R) de la proteína. La caracterización de los mutantes ha llevado a la identificación de residuos esenciales para la biogénesis (Ile711, Leu7lZP, he713,G I u~'y~ G ly1413),p ara la función (Gly663G, ly756A, sp777,G ly1306Y Gly1311) Y para la regulación (IleS4', TyrsS, Alagi0 y Arg1143)d e Ycflp. Una segunda aproximación ha consistido en el análisis de supresión intragénica de cinco mutaciones localizadas en los dominíos NBDl (G663V, G756D y D777N) o NBD2 (G1306E y G1311R) e implicadas en la unión y/o hidrólisís de ATP. Todos los revertientes de los mutantes G663V, G756D, G1306E y G1311R resultaron ser reversiones de la mutación primaria a la secuencia silvestre. En cambio se han aislado trece mutaciones supresoras de la mutación D777N localizadas en los dominios: TMDl (V543I y F565L), TMD2 (A1003V, A1021T, A1021V, N1027D, Q1107R, G1207ü, G1207ü, S1212L y W1225C), NBDl (S674L) y NBD2 (R1415G). Esta localización demuestra la-íteracción física y/o funcional de NBDl con los otros tres dominios. La caracterización de los mutantes supresores indica que el mecanismo de supresión implica una alteración en la especificidad de sust.rato.

The yeast cadmium factor (Ycflp) is a vacuolar protein involved in resistance to Cd2+ and to exogenous glutathione S-conjugate precursors in yeast. It belongs' to the superfamily of ATP binding cassette transporters, which includes the human cystic transmembrane conductance regulator (CFTR) and the multidrug resistance-associated protein (MRP1). The prímary objective of the present study has been to analyze in depth the structural and functional relationships of Ycflp protein. In a first approach twenty-two single mutations were generated by sitedirected mutagenesis in conserved residues located in the nucleotide binding (NBD1 and NBD2), transmembrane (TMD2) and regulatory (R) domains of the protein. Mutants characterization has identified essential residues for Ycflp biogenesis (Ile711, Leu71: Phe713, G ~ Y u ~ ~func~tion (Gly663,G lyn6, Aspm, GlyI3O6 y Gly1311) and regulation (Ilea4', Tyrs", Alag1' and Arg1143). In a second approach we have performed an intragenic suppressor analysis of five inactive mutations located in NBDl (G663V, G756D y D777N) or NBD2 (G1306E y G1311R) and involved in ATP bindíng and/or hydrolysis. Revertants from G663V, G756D, G1306E y G1311R mutants corresponded to full revertants of the initial mutation. Thirteen second-site suppressor mutations have been isolated for D777N mutation. Suppressor mutations are located ín the domains: TMDl (V543I y F565L), TMD2 (A1003V, A1021T, AlOZlV, N1027D, Q1107R, G1207D, G1207S, S1212L and W1225C), NBDl (S674L) and NBD2 (R1415G). These results demonstrate the interaction, direct or indirect, between NBDl and the other three domains. Characteriiation of the suppressor mutants shows that changes in substrate specificity of the protein are involved in the suppression mechanism.