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Identificación de péptidos y fármacos inhibidores basados en un nuevo mecanismo de inactivación para p38 MAPK
Author
Campos Muelas, Pedro ManuelEntity
UAM. Departamento de Biología MolecularDate
2016-01-20Subjects
Proteínas quinasas activadas por mitógenos - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 20-01-2016Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
La vía de señalización de p38 MAPK puede ser activada por diferentes estímulos como
inflamación o estrés oxidativo, y está implicada en multitud de procesos celulares como
proliferación, diferenciación, apoptosis y supervivencia mediante la regulación de la
expresión de diversos genes, incluyendo citoquinas proinflamatorias. El desarrollo de
un inhibidor potente, selectivo y seguro para p38 ha sido un objetivo perseguido por la
ciencia básica y la industria farmacéutica durante los últimos años que no se ha
conseguido principalmente por falta de selectividad y efectos secundarios.
El descubrimiento en nuestro laboratorio de un nuevo mecanismo de inhibición de p38α
mediante la fosforilación por GRK2 (quinasa de receptores acoplados a proteínas G) en
el residuo treonina 123, situado a la entrada del surco de anclaje de p38, nos ha
permitido desarrollar una estrategia alternativa de inhibición dirigida a este dominio. El
surco de anclaje es un dominio exclusivo de las MAPK que aporta afinidad y
especificidad hacia sus sustratos y moduladores. En este trabajo hemos descubierto que
la fosforilación de p38 por GRK2 puede bloquear la interacción de p38 con sustratos y
activadores. Igualmente, hemos demostrado que GRK2 también puede fosforilar a la
isoforma p38β2 en la serina 123. El mutante de p38β2 que imita la fosforilación por
GRK2 fosforila con menos eficiencia aquellos sustratos que interaccionan con p38 a
través del surco de anclaje. Además, este mutante muestra una capacidad catalítica
alterada sobre sustratos independientes del surco de anclaje. Adicionalmente, hemos
demostrado que GRK2 fosforila preferentemente a p38 en estado inactivo y que PP2A
puede revertir in vitro esta fosforilación.
Según estos resultados, hemos desarrollado una serie de péptidos diseñados a partir de
los motivos-D de diversas proteínas que interaccionan con p38 incluyendo MKK6,
MK2 y MEF2A para intentar inhibir la actividad y/o la activación de p38. Algunos de
estos péptidos mostraron actividad inhibitoria sobre p38 in vitro y en células en el rango
micromolar. El más eficaz fue el diseñado a partir de MEF2A fusionado con el péptido
transportador de membrana TAT, y cuya secuencia fue modificada introduciendo una
cisteína para intentar establecer un puente disulfuro con la cisteína 119 de p38. El
péptido resultante, TAT-MEF2AxCys, mostró una potencia superior al péptido original
de MEF2A, probablemente debido a la formación de este enlace, ya que el efecto
inhibitorio es atenuado en presencia de un agente reductor. Este péptido inhibió la
actividad de p38 in vitro con una IC50 de 3,7mM y bloqueó completamente la secreción
de TNFa en la línea monocítica humana THP-1 a una concentración de 10mM y con
una IC50 de 3mM. La sustitución de los aminoácidos L por sus enantiómeros D, siendo
así resistentes a proteasas, mantuvo el efecto inhibitorio. Sin embargo, ambos péptidos
redujeron la viabilidad de las células THP-1 a concentraciones no mucho mayores que
las requeridas para la inhibición.
Como aproximación alternativa, hemos identificado compuestos inhibidores de p38
seleccionados mediante cribado virtual dirigido al surco de anclaje de p38. Algunas
familias de compuestos mostraron actividad inhibitoria de la ruta de p38 in vitro y en
células. Entre ellas, la familia de benzo-oxadiazoles, en concreto el compuesto FGA-19,
bloqueó completamente la actividad de p38 y la secreción de TNFα en células THP-1 a
una concentración de 10mM, con una IC50 de 1,8mM y con una ventana de dos órdenes
de magnitud entre las dosis inhibitorias y las dosis tóxicas medias. Es interesante
resaltar que ambos, péptido TAT-MEF2AxCys y el compuesto FGA-19, pueden inhibir
eficazmente p38 en un modelo murino de hiperalgesia inflamatoria, reduciendo la
sensibilidad al dolor de los ratones, durante al menos 5 días, a niveles similares a los
encontrados en los ratones control, con una concentración menor y un efecto más
prolongado que el de inhibidores establecidos de p38 competitivos para el ATP. p38 MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) signaling pathway is preferentially
activated by different kinds of stress such as inflammation and oxidative stress and is
implicated in diverse biological processes such as proliferation, differentiation,
apoptosis and survival. p38 exerts its activity through the regulation of the expression
of many genes including proinflammatory cytokines. The development of a strong,
selective and safe inhibitor capable of regulating p38 activity has been pursued by
academia and pharmaceutical industry during the last years without success, mainly
because of the lack of selectivity and toxic secondary effects.
The discovery in our lab of a new inhibitory phosphorylation of p38a by the
multifunctional G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) in threonine 123, a residue
located at the entrance of the p38´s docking groove, has led us to the development of a
new inhibitory strategy targeting this domain. The docking groove is a specific MAPK
family cleft that confers affinity and specificity towards MAPK molecular partners. In
this project we have characterized the effects of p38 phosphorylation by GRK2, and we
have unveiled that it is able to block the interaction of p38 with both upstream activators
and downstream substrates. We have also shown that GRK2 can phosphorylate the
p38b2 isoform, in a serine at position 123. Moreover, a mutant of p38b2 that mimics
GRK2 phosphorylation phosphorylates less efficiently those substrates that interact with
p38 via the docking groove. Furthermore, this mutant shows an altered catalytic activity
also towards docking-independent substrates. We have also characterized that GRK2
preferentially targets inactive p38, and that this phosphorylation can be reverted in vitro
by PP2A phosphatase.
Based on these results, we have developed a series of peptides designed from the
D-motif of several molecular partners of p38 including MK2, MKK6 and MEF2A to try
to inhibit p38 activity and/or activation. Several of these peptides showed an inhibitory
activity towards p38 both in vitro and in cells in the micromolar range. The most
effective one was based on MEF2A, linked to the cell-penetrating TAT peptide and
whose sequence was modified introducing a cysteine to try to establish a disulfide bond
with cysteine 119 in p38. The resulting peptide, TAT-MEF2AxCys, showed greater
potency than the original MEF2A sequence, probably due to the formation of this
disulfide bond since its inhibitory effect can be overcome by treatment with a reducing
agent. This peptide inhibits p38 activity in vitro with and IC50 of 3.7mM and
completely blocks TNFa secretion in human monocitic THP-1 cells at a 10mM
concentration with an IC50 of 3mM. Replacement of L-aminoacids by D-enantiomers,
thus creating protease-resistant peptides, maintains the inhibitory efficacy. However,
both peptides decreased the viability of the THP-1 cells at concentrations not much
higher than those required for the observed inhibitory effects.
As an alternative approach, we have identified small molecule p38 inhibitors based on
virtual screening on the p38 docking groove. Several families of compounds were found
to have inhibitory activity in vitro and in cells towards the p38 route. Among them, the
benzo-oxadiazol family, in particular the FGA-19 compound, completely abrogated p38
activity and TNFa secretion at concentrations of 10mM in THP-1 cells with an IC50 of
1.8mM and a reliable safety profile with two orders of magnitude between mean active
and toxic doses. Interestingly, both the TAT-MEF2AxCys peptide and the small
molecule FGA-19 can act as effective p38 inhibitors in a murine model of inflammatory
hyperalgesia, reducing mice pain sensitivity for at least 5 days, to a level similar to that
in control animals, at lower dose and lasting longer than established ATP-competitive
p38 inhibitors.
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