Efecto de la inhibición de la n-glicosilación en la funcionalidad del receptor de glutamato tipo NMDA: activación de vías de estrés del retículo endoplásmico
Author
García-Gallo Pinto, MónicaEntity
UAM. Departamento de BioquímicaDate
2000-06-16Subjects
Proteínas nerviosas - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / Biología; MedicinaNote
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 16-06-2000Abstract
Los receptores de glutamato de tipo NMDA son proteínas heteroméricas localizadas en la membrana de las densidades postsinápticas, que se activan en respuesta a la unión de glutamato y glicina y simultánea despolarización de la membrana, dando lugar a la entrada de iones calcio desde el exterior celular a través de un canal iónico contenido en su estructura.
En esta tesis se ha desarrollado un sistema heterólogo de expresión de receptores NMDA en células no neuronales, basado en la utilización de1 virus de la vacuna. Este sistema ha permitido la expresión de receptores funcionales en la superñcie celular que, en respuesta a la adición de agonistas, inducen muerte celular por excitotoxicidad. Así mismo, se han abordado cuestiones relativas a la maduración, localización y ensamblaje de las subunidades del receptor expresadas (NR1 y NRSA) así como la expresión diferencial de las subunidades. Se ha observado que mientras NR1 es transportada eficientemente a la membrana plasmática en ausencia de expresión de NR2A, esta última precisa la co-expresión de NR1 para alcanzar la superficie celular.
Dado que estas subunidades son proteínas N-glicosiladas, se ha estudiado el efecto de la inhibición de la N-glicosilación en la funcionalidad del receptor. Los resultados indican que, en ausencia de N-glicosilación, el receptor expresado en el sistema heterólogo no es funcional debido a la retención de las subunidades en compartimentos intracelulares y a la degradación específica de la subunidad NR1 no glicoslada. Estudios realizados en cultivos de neuronas corticales de rata vindican que dicha degradación está relacionada con la activación de respuestas de estrés de retículo endoplásmico y requiere la activación del proteasoma. The N-Methyl-D-Aspartate (Nh4DA) receptors, a distinct subgroup of ionotropic glutamate receptors, are heteromeric proteins in the membrane of postsynaptic densities. Upon simultaneous binding of glutamate and the co-agonist glycine and depolarization of the membrane, there is activation of the intrinsic calcium channel of the receptor.
In this investigation, a heterologous system of expression of NMDA receptors has been developed, based on vaccinia virus. Using this system, we have been able to produce functional receptors that respond to agonists by inducing excitotoxic cell death. We have also analyzed the maturation, transport, assembly and differential expression of NR1 and NR2A subunits. With this approach we have demonstrated that NR1 subunit is efficiently expressed in the plasma membrane in the absence of NR2A subunit, while the latter needs the presence of NRI.
Since these subunits are N-glycosylated, we have addressed the effect of the inhibition of Nglycosylation on receptor functionallity. We have found that the receptors are not functional due to intracellular accumulation of the subunits and specific degradation of nonglycosylated NR1 protein. In cultured rat cortical neurons, it was demonstrated that degradation of NR1 is related to the activation of endoplasmic reticulum stress responses, and requires proteasome functionallity.
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