Desarrollo de vectores de clonaje a partir del plasmido pPS10 de "Pseudomas savastanoi" y caracterización de su replicón básico
Author
Nieto Mazarrón, ConcepciónEntity
UAM. Departamento de Biología MolecularDate
1988-11-29Subjects
Pseudomonas - Tesis doctorales; Ingeniería genética - Tesis doctorales; Vectores de clonación - Tesis doctorales; Plasmidos - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leida en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 29 de Noviembre de 1988.Abstract
EI aislamiento y caracterización del replicón básico del plásmido Pps10, específico de P.savastanoi, ha permitido construir una colección de vectores de clonaje útiles para manipulaciones genéticas en Pseudomonas.
El replicón básico de pPS1O está contenido en un fragmento de 1823 pb. El análisis de su secuencia ha servido para identificar una serie de regiones implicadas en el mantenimiento estable del plásmido.
El origen de replicación está contenido en una región de 535 pb. Esta región incluye 4 secuencias repetidas de forma directa de 22 pb, seguidas de una región rica en A-T y otra rica en G-C. Además, se ha localizado una caja DnaA que difiere en una base de la secuencia consenso descrita para E. coli.
Entre las coordenadas 575 y 1268 se ha identificado un marco de lectura abierto, que codifica para una proteína de 26.7 KDa. Esta proteína, denominada RepA, es necesaria para la replicación del plásmido pPSlO y puede actuar en "trans". RepA es capaz de regular su propia síntesis, actuando muy probablemente sobre las seañales de inicio de su transcripción y/o traducción.
Próxima al extremo 5' del replicón básico, se ha encontrado una región, de aproximadamente 100pb, con capacidad de “bending”, que incluye un posible terminador de transcripción. La delección de esta región da lugar a un descenso del número de copias en un plásmido derivado de pPSlO, y afecta a la expresión de la proteina RepA.
A partir de1 miniderivado de pPSlO, pCN38, se han construido una serie de vectores que presentan varios sitios de corte único para enzimas de restricción, distintos marcadores seleccionables y un número de copias similar al del plásmido original.
La caractezación del replicón mínimo ha permitido la elaboración de un conjunto de nuevos vectores de clonaje para Pseudomonas con un número de copias variable, dependiendo del fondo genético utilizado.
La construcción de cointegrados entre replicones específicos de E. coli y pPSlO, ha permitido el establecimiento de este plásmido en esta estirpe bacteriana.
La utilización de estos cointegrados, ha hecho posible valorar la actividad de señaales de expresión de genes vir de A. tumefaciens en P. savastanoi y E. coli.
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