El virus del mosaico del pepino. Análisis de la función de la proteina P3a y efecto de la expresión de secuencias derivadas del gen 3a en la infección viral

Abstract

El virus del mosaico del pepino (CMV), miembro tipo del género de los cucumovirus, posee un genoma constituido por tres moléculas de ácido ribonucleico de sentido mensajero, denominadas RNA 1, 2 y 3 en orden decreciente de tamaño. El RNA 3, aunque dispensable para la replicación de los RNAs 1 y 2 en protoplastos es necesario para el establecimiento de una infección sistémica en la planta huésped. El RNA 3 codifica dos proteínas, la proteína p3a en su extremo 5'-terminal y la proteína de la cápsida viral en su extremo 3'-terminal.

Con el fin de estudiar la funcionalidad de la proteína p3a y de desarrollar un sistema que permita analizar los dominios funcionales de dicha proteína, hemos analizado la capacidad de la proteína p3a de CMV-24 expresada en plantas transgénicas para complementar el movimiento defectivo de otra cepa de CMV. Esta capacidad es dependiente de la cantidad de la proteína p3a acumulada en las plantas transgénicas. Además, el movimiento del virus defectivo en la hoja inoculada sufre un retraso respecto al del virus silvestre, y su movimiento sistémico se encuentra alterado resultando en un patrón atípico de invasión del virus en la planta transgénica y una atenuación de los síntomas. Estos resultados indican que los procesos iniciales de la infección viral son determinantes para la sintomatología y la invasión sistémica de las plantas.

Además hemos abordado la posibilidad de obtener resistencia a la infección por CMV mediante la expresión en plantas transgénicas de secuencias derivadas del gen 3a. Para ello, se han construido diez mutaciones por delección en la región central del gen 3ª de CMV-24, y se ha analizado la susceptibilidad a la infección por el mismo virus en las plantas que expresan esas delecciones. Ninguna de las líneas de plantas transgénicas aquí analizadas mostró una inhibición de la acumulación viral, si bien las líneas de las plantas transgénicas que expresaban dos mutaciones mostraron una disminución significativa en la acumulación viral. Adicionalmente, las plantas transgénicas que expresaban otras dos mutaciones acumulaban mayor cantidad de virus que las plantas control.

Por otra parte hemos analizado la protección frente a la infección vital mediada por un RNA complementario a la secuencia de gen 3a y regiones adyacentes (89 nt de la región 5' líder y 86 nt de la región intergénica) de CMV-24 cuando se expresa en plantas transgénicas. En las dos líneas de plantas transgénicas seleccionadas, L50 y L64, se detectó una interferencia con la infección viral que se caracteriza por un retraso en la aparición de los síntomas y una menor acumulación de virus en las plantas, siendo este efecto más notorio en la línea que acumulaba altos niveles del transgen. La protección se manifestaba también cuando el inóculo era en forma de RNA y era dependiente de la dosis de inóculo, siendo superada cuando las plantas se inoculaban con altas concentraciones de virus o RNA.

El estudio de la cinética de acumulación de los RNAs vitales y de las proteínas p3a y CP en las plantas de la línea L50, nos permitió detectar un retraso en su aparición y una disminución de la cantidad acumulada a lo largo de todos los días analizados, en los RNAs y en las proteínas, tanto en las hojas inoculadas como en las hojas superiores a estas. Asimismo, por impresión de las hojas en membranas e inmunodetección de la CP sobre ellas, se ha detectado una interferencia con el movimiento del virus en la hoja inoculada, con especial incidencia entre los 3-4 d.p.i.

En su conjunto estos datos prueban que la proteína p3a de CMV es la proteína de movimiento de CMV y que es posible obtener resistencia frente a la infección de este virus en plantas transgénicas que expresan un mRNA en sentido antimensajero frente al gen 3a. Los transcritos de este RNA en las plantas parecen interferir con el proceso de la infección viral a distintos niveles incluyendo la replicación viral, la traducción de los productos codificados en el RNA 3 y el movimiento del virus a corta distancia.