Caracterización del gen que codifica la subunidad "alpha" de la H+ -ATP sintetasa de "Drosophila melanogaster"
Author
Talamillo Cancelo, AnaAdvisor
Garesse Alarcón, Rafael
Entity
UAM. Departamento de Biología Molecular; UAM. Departamento de BioquímicaDate
1997-03-10Subjects
Drosophilas - Genética - Tesis doctorales; Adenosina-trifosfatasa - Tesis doctorales; Mitocondrias - Genética - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Bioquímica y Biología molecular. Fecha de lectura: 10-03-1997Abstract
Los requerimientos energéticos de la cklula se obtienen principalmente mediante el
proceso de fosforilación oxidativa que tiene lugar en la mitocondna. De los cinco
complejos de la cadena respiratoria que intervienen en este proceso, cuatro de ellos
poseen subunidades codificadas en genomas diferentes, el nuclear y el mitocondrial. La
funcionalidad de la mitocondria depende por tanto de la expresión coordinada de ambos
genomas. En nuestro grupo nos hemos propuesto estudiar la biogénesis mitocondrial
utilizando Drosophila melanogaster como sistema modelo. Para ello hemos centrado el
estudio en la regulación de la expresión de genes nucleares que codifican subunidades de la cadena respiratoria. En este trabajo se describe la caracterización del gen que codifica la subunidad a de la H + - A T P ~(a~-A~T Pasa) de D. melanogaster. Existe un único gen localizado en el brazo izquierdo del segundo cromosoma que ocupa una región de aproximadamente 3 kb y esta organizado en cuatro exones y tres intrones. La subunidad a-ATPasa de D. melanogaster posee una identidad de secuencia muy elevada con las subunidad a- ATPasa caracterizadas en otros organismos. El gen posee un inicio de transcripción heterogéneo y se han identificado dos posibles secuencias iniciadoras en la región 5' proximal mediante la comparación con los inicios de transcripción caracterizados en los genes a-ATPasa de mamíferos. El análisis de la secuencia de 3 kb de la región 5' del gen ha permitido localizar secuencias consenso para varios factores de transcripción generales y para algunos factores identificados en genes mitocondriales que podrían regular su expresión. Se ha caracterizado en células en cultivo la actividad promotora de 1 kb de la región 5' del gen lo que ha permitido definir diversas regiones a las que podrían unirse proteínas que modulan de un modo negativo o positivo la transcripción y una región indispensable para la transcripción basa1 del gen. El estudio de la expresión del gen ha revelado que los niveles en estado estacionario del mRNA a-ATPasa y de otros transcritos mitocondriales codificados en diferentes genomas varían dependiendo del tejido, siendo estos niveles más elevados en aquellos tejidos que poseen las mayores demandas respiratorias. El patrón de expresión del gen a-ATPasa durante el desarrollo embrionario de Drosophila es similar al caracterizado en otras subunidades del mismo complejo (B-ATPasa y ATPasa 6-8), disminuyendo los niveles de mRNA en los primeros estadios de embriogénesis hasta aproximadamente las 6 horas de desarrollo que comienza a aumentar su expresión hasta alcanzar los niveles detectados en adultos. Estos resultados sugieren que tanto en el desarrollo embrionario como a nivel tisular existe una fina coordinación en la expresión de los genomas mitocondrial y nuclear. The cellular ATP is mainly generated by the process of oxidative phosphorylation
taking place within mitochondria. Four out of the five respiratory chain complexes which
contribute to this pathway, depend on both nuclear and mitochondrial encoded products,
and therefore the mitochondrial function relies on the coordinated expression of both
genomes. Our group is interested in the study of mitochondrial biogenesis using D.
melanogaster as a model system. We have focused this study in the mechanisms that
regulate the expression of nuclear encoded subunits of the mitochondrial respiratory
chain. This thesis focuses on the characterization of the gene encoding the a subunit of
the H+-ATP synthase (ATPase) of D. melanogaster: This single copy gene maps in the
left ami of the second chromosome covering a region of roughly 3 kb and is organized
in 4 exons and 3 introns. The deduced amino acid sequence of the D. melanogaster a-
ATPase subunit shows a high identity to their counterparts characterized in other
systems. The gene has an heterogeneous transcription initiation site and two putative
initiator sequences identified by comparative analysis of the 5' proximal region of the
mammalian and D. melanogaster genes. The sequence analysis of 3 kb 5' flanking region of the gene reveals the presence of several cis elements that regulate in mammals the expression of oxidative phosphorylation specific genes as well as other recognition
sequences for several transcription factors. We have evaluated in cell culture the
promoter activity of the 5' region of the gene and the characterization of 1 kb 5' proximal
region has led to the identification of several regions which can mediate the action of
putative positive or negative regulatory factors and a region that is essential for the basa1
transcription of the gene. The study of the expression of the a-ATPase gen has revealed
that the steady-state level of this mRNA and other nuclear- and mitochondrial-encoded
transcripts are higher in tissues with high respiratory demand. The expression pattern of
the a-ATPase transcript during Drosophila embryonic development is similar to the
pattern expression previously characterized in other subunits of the H + - A T P ~co~m~p lex (B-ATPase and ATPase 6-8). The steady-state level of these transcripts decrease during the fust embryonic stages and increase after 6 hours of development reaching a plateau that is maintained in adults. These results suggest that during embryonic development and at tissue level there is a fine coordiiation in the expression of the nuclear and mitochondrial genomes.
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