Bases moleculares de las mejoras biotecnológicas conferidas a los vectores baculovirus por el casete de expresión TB y su aplicación en la producción de diferentes vacunas de subunidades

Abstract

Desde su descripción como una tecnología de expresión transitoria alternativa para la producción de proteínas recombinantes a comienzos de los años 80, el Sistema de Expresión basado en el uso de Vectores Baculovirus (BEVS) se ha alzado como una tecnología puntera para la producción de proteínas heterólogas en un ambiente eucariótico. En contraposición con los largos procesos de producción de proteínas recombinantes en cultivos celulares de mamífero, el uso de BEVS reduce considerablemente tanto los tiempos de desarrollo como los costes asociados al proceso productivo. Sin embargo, las consecuencias de la replicación vírica en las células hospedadoras, como el efecto citopático que degrada progresivamente todo el contenido intracelular incluyendo a la proteína heteróloga de interés, han supuesto diferentes inconvenientes que han disminuido su competitividad a la hora de ser adoptada universalmente por la industria farmacéutica. Además, esta degradación intracelular es concomitante con la actividad óptima del promotor vírico que regula la expresión de la proteína de interés, provocando su acumulación en formas aberrantes o degradadas o la disminución en la eficiencia del mecanismo de su secreción. Todo ello contribuye a una disminución significativa de la funcionalidad de la proteína producida o de su propia acumulación dentro o fuera de la célula. No obstante, numerosas proteínas recombinantes han sido producidas eficientemente mediante BEVS, reflejadas en el creciente nº de artículos científicos publicados y en el empleo de esta tecnología en la producción industrial, representado por la aprobación de algunas moléculas derivadas de células de insecto para su uso en salud humana y veterinaria, principalmente en el campo de las vacunas. Esto resalta la importancia del estudio y desarrollo de estrategias que superen las limitaciones de este sistema de expresión recombinante. Respecto a las mejoras realizadas sobre el vector baculovirus, los vectores modificados con el casete de expresión denominado TB, han supuesto un avance significativo en términos de calidad y cantidad de las proteínas recombinantes expresadas debido a la reducción del efecto citopático que muestran los las células de insecto infectadas con estos vectores respecto al uso de vectores baculovirus convencionales. El mantenimiento de la viabilidad de las células infectadas con el vector TB durante un mayor tiempo post-infección permite una mayor acumulación de proteína recombinante y una mejora de su procesamiento post-traduccional. Pero, hasta el momento no se había descrito el mecanismo por el cual el casete TB provoca estos efectos en las células infectadas. Por ello, el objetivo de este trabajo de Tesis ha sido investigar las bases moleculares de los cambios observados con los vectores TB. Además, se ha caracterizado la expresión óptima de proteínas complejas mediante vectores TB, tradicionalmente consideradas difíciles de expresar correctamente en este sistema de expresión. Para ello, se seleccionó una glicoproteína y una proteína estructural auto-ensamblable, capaz de conformar VLPs (virus-like particles), ambas de interés comercial. Los resultados obtenidos en este trabajo han permitido concluir que los elementos reguladores genéticos incorporados al casete TB retrasan el disparo de la señal apoptótica en las células infectadas, retardando la aparición de los efectos citopáticos y la degradación de los elementos intracelulares y mejorando el rendimiento productivo y la calidad de los modelos proteicos expresados obtenido respecto a los cultivos celulares infectados con un vector baculovirus convencional.

Since its description as a newly expression technology for transiently production of heterologous proteins in the early 80’s, the Baculovirus Expression Vector System is a transient technology that is being risen as a breakthrough technology for the production of proteins of interest in a eukaryotic environment. Opposite to the long-time consumption procedures related with mammalian cells, the use of the Baculovirus Expression Vector System remarkably reduces the manufacturing times and the production-associated costs. However, the consequences of viral replication inside the host cells, such as the cytopathic effect which progressively degrades all the intracellular content including the recombinant protein of interest, have meant different withdraws and this technology has occasionally been out of the scope of the pharmaceutical industry. Moreover, this highest intracellular degradation occurs concordantly with the optimal promoter activity showed by the viral promoter controlling the expression of the heterologous protein. This implies a negative effect on the recombinant protein expression, which can lead into aberrant protein folding, protein aggregates accumulation or a low secretion yield which means severe deleterious effects on the protein global production. Nevertheless, several proteins has been produced with this technology over the last 30 years, being some of them approved for human and animal health care proposes like immunogens. This statement highlights the importance of studying and promoting any improvement on it. Regarding this, a number of strategies have been proposed to overcome the described limitations. Focusing on the baculovirus vector, the recently described TB cassette has supposed a significant advance in terms of quantity and quality of the expressed proteins due to the reduced cytopathic effect displayed by the infected cell cultures when comparing with those infected with a conventional baculovirus vector. Thus, the maintenance of sustained-viable TB-infected cells allows a higher expression rates combined with better quality and leading to a wider expression window. However, it has never been described how a TB-modified baculovirus vector causes these effects on the infected cells. So the main propose of this PhD dissertation is to describe the mechanism/s by which the TB cassette induces the mentioned effects. In addition, we decide to test the potency of expression of this newly baculovirus vector in the production of complex proteins of interest, such as glycoproteins or self-assembling proteins, like those conforming pseudo-viral particles (VLPs), those are commonly used like immunogens in health care purposes. The described results obtained in this PhD dissertation lead to conclude that the genetic regulatory elements presented in TB-improved vectors delay the apoptotic trigger, which retard the cytopathic effect and the degradation of the intracellular elements in the TB-infected cells. These effects, in combination with the highly-strong promoter region located in the TB cassette that controls the expression of the recombinant protein, allow a significant increase in the production yields of the complex heterologous proteins selected in this dissertation when comparing to those yields achieve in cell cultures infected with conventional baculovirus vectors.