Desarrollo y caracterización de aptámeros de RNA y DNA frente a la proteína ErbB3 binding protein-1 mediante procedimientos de selección y evolución in vitro

Abstract

El principal objetivo de esta Tesis ha sido el desarrollo y caracterización de aptámeros específicos frente a la proteína ErbB3-binding protein 1 (Ebp1). Los aptámeros, de DNA y RNA, se obtuvieron mediante selección in vitro y evolución in vitro. Las poblaciones finales de los cuatro procesos se analizaron y compararon para detectar y caracterizar los mejores aptámeros, así como para evaluar las estrategias utilizables para la obtención de los mismos. Los aptámeros son moléculas de DNA de cadena sencilla o de RNA, seleccionadas a partir de poblaciones combinatoriales mediante un proceso conocido como SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment), que son capaces de unirse específicamente a un ligando determinado. En comparación con otras moléculas de unión (naturales o sintéticas) los aptámeros poseen propiedades químicas y bioquímicas únicas, entre las que destaca la posibilidad de ser seleccionados frente a cualquier tipo de diana, incluso en condiciones no fisiológicas. Desde la aparición de la tecnología SELEX, en 1990, se han obtenido numerosos aptámeros con alta especificidad y afinidad frente a un amplio rango de moléculas diana, entre ellas proteínas, ácidos nucleicos y complejos macromoleculares de gran relevancia en virología. En este trabajo se han desarrollado aptámeros frente a ErbB3-binding protein 1 (Ebp1), una proteína ITAF (IRES-trans acting factor) también conocida ITAF45 y PA2G4, que estimula la traducción de la poliproteína del virus de la fiebre aftosa (FMDV) mediante su unión al IRES viral. Los principales objetivos de esta Tesis fueron: I) Obtener aptámeros de ssDNA y de RNA frente a la proteína Ebp1, comparando los procesos de selección in vitro de ambos ácidos nucleicos (DS, RS) con los de evolución in vitro (DE, RE), realizados en paralelo; II) Combinar la especificidad de los aptámeros por sus dianas con la sensibilidad de la amplificación de ácidos nucleicos mediante PCR a tiempo real para conseguir un método de detección ultrasensible basado en el ELONA-qPCR; III) Aplicar el sistema de ELONA-qPCR desarrollado a la caracterización funcional (incluyendo la cuantificación de la constante de disociación, Kd, y la capacidad de unión máxima, Bmax) de los aptámeros obtenidos; IV) Identificar motivos cortos de secuencia/estructura presentes en los aptámeros de alta afinidad que podrían estar implicados en la interacción aptámero- Ebp1; y V) Realizar una caracterización preliminar de la estructura tridimensional del IRES de FMDV, de Ebp1 y de complejos IRES-Ebp1 mediante microscopía de fuerza atómica (AFM).

This Thesis is aimed to the development and characterization of aptamers specific to the ErbB3-binding protein 1 (Ebp1). DNA and RNA aptamers have been developed by means of in vitro selection as well as by in vitro evolution. The final populations of the four processes were analyzed and compared in order to find the best aptamers, as well as to evaluate the strategies for aptamers development. Aptamers are single-stranded DNA or RNA molecules selected from large combinatorial libraries through a process referred to as SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) that are able to specifically bind to a desired target molecule. As compared to other natural and synthetic binding molecules, aptamers possess unique chemical and biochemical features, including the ability to be selected against virtually any target, even in non-physiological conditions. Since the set up of SELEX technology in 1990, many aptamers have been developed with high specificity and affinity to a broad range of target molecules, some of them being proteins, nucleic acid regions and macromolecular assemblies highly relevant in virology. In this work, we have developed aptamers against the ErbB3-binding protein 1 (Ebp1), an IRES-trans acting factor also known as ITAF45 and PA2G4 that stimulates translation driven by the FMDV IRES. The main objectives of this Thesis were the following: I) To obtain DNA and RNA aptamers against the protein Ebp1, comparing in vitro selection methods (DS, RS) with in vitro evolution processes (DE, RE) performed in parallel; II) To combine the specificity of the aptamers for their target molecules with the sensitivity of real-time nucleic acid amplification to set up an ultrasensitive detection method based on ELONA-qPCR; III) To apply the developed ELONAqPCR system to the functional characterization (including the quantification of the dissociation constant, Kd, and maximum binding capacity, Bmax) of the obtained aptamers; IV) To identify short sequence/structure motifs present in the high affinity aptamers that could be involved in the aptamer-Ebp1 interaction; V) Finally, to perform a preliminary analysis of the three-dimensional structure of FMDV IRES, Ebp1 and IRES-Ebp1 complexes by means of atomic force microscopy (AFM).