Desarrollo y caracterización de aptámeros de RNA y DNA frente a la proteína ErbB3 binding protein-1 mediante procedimientos de selección y evolución in vitro
Autor (es)
Lanagrán Valero, Eva MaríaEntidad
UAM. Departamento de Biología Molecular; Centro de Astrobiología (CAB)Fecha de edición
2016-10-18Materias
Ácidos nucléicos - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNota
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 18-10-2016
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Resumen
El principal objetivo de esta Tesis ha sido el desarrollo y caracterización de aptámeros
específicos frente a la proteína ErbB3-binding protein 1 (Ebp1). Los aptámeros, de DNA y RNA, se
obtuvieron mediante selección in vitro y evolución in vitro. Las poblaciones finales de los cuatro
procesos se analizaron y compararon para detectar y caracterizar los mejores aptámeros, así como
para evaluar las estrategias utilizables para la obtención de los mismos.
Los aptámeros son moléculas de DNA de cadena sencilla o de RNA, seleccionadas a partir
de poblaciones combinatoriales mediante un proceso conocido como SELEX (Systematic Evolution
of Ligands by EXponential enrichment), que son capaces de unirse específicamente a un ligando
determinado. En comparación con otras moléculas de unión (naturales o sintéticas) los aptámeros
poseen propiedades químicas y bioquímicas únicas, entre las que destaca la posibilidad de ser
seleccionados frente a cualquier tipo de diana, incluso en condiciones no fisiológicas. Desde la
aparición de la tecnología SELEX, en 1990, se han obtenido numerosos aptámeros con alta
especificidad y afinidad frente a un amplio rango de moléculas diana, entre ellas proteínas, ácidos
nucleicos y complejos macromoleculares de gran relevancia en virología. En este trabajo se han
desarrollado aptámeros frente a ErbB3-binding protein 1 (Ebp1), una proteína ITAF (IRES-trans
acting factor) también conocida ITAF45 y PA2G4, que estimula la traducción de la poliproteína del
virus de la fiebre aftosa (FMDV) mediante su unión al IRES viral.
Los principales objetivos de esta Tesis fueron: I) Obtener aptámeros de ssDNA y de RNA
frente a la proteína Ebp1, comparando los procesos de selección in vitro de ambos ácidos nucleicos
(DS, RS) con los de evolución in vitro (DE, RE), realizados en paralelo; II) Combinar la
especificidad de los aptámeros por sus dianas con la sensibilidad de la amplificación de ácidos
nucleicos mediante PCR a tiempo real para conseguir un método de detección ultrasensible basado
en el ELONA-qPCR; III) Aplicar el sistema de ELONA-qPCR desarrollado a la caracterización
funcional (incluyendo la cuantificación de la constante de disociación, Kd, y la capacidad de unión
máxima, Bmax) de los aptámeros obtenidos; IV) Identificar motivos cortos de secuencia/estructura
presentes en los aptámeros de alta afinidad que podrían estar implicados en la interacción aptámero-
Ebp1; y V) Realizar una caracterización preliminar de la estructura tridimensional del IRES de
FMDV, de Ebp1 y de complejos IRES-Ebp1 mediante microscopía de fuerza atómica (AFM). This Thesis is aimed to the development and characterization of aptamers specific to the
ErbB3-binding protein 1 (Ebp1). DNA and RNA aptamers have been developed by means of in
vitro selection as well as by in vitro evolution. The final populations of the four processes were
analyzed and compared in order to find the best aptamers, as well as to evaluate the strategies for
aptamers development.
Aptamers are single-stranded DNA or RNA molecules selected from large combinatorial
libraries through a process referred to as SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential
enrichment) that are able to specifically bind to a desired target molecule. As compared to other
natural and synthetic binding molecules, aptamers possess unique chemical and biochemical
features, including the ability to be selected against virtually any target, even in non-physiological
conditions. Since the set up of SELEX technology in 1990, many aptamers have been developed
with high specificity and affinity to a broad range of target molecules, some of them being proteins,
nucleic acid regions and macromolecular assemblies highly relevant in virology. In this work, we
have developed aptamers against the ErbB3-binding protein 1 (Ebp1), an IRES-trans acting factor
also known as ITAF45 and PA2G4 that stimulates translation driven by the FMDV IRES.
The main objectives of this Thesis were the following: I) To obtain DNA and RNA
aptamers against the protein Ebp1, comparing in vitro selection methods (DS, RS) with in vitro
evolution processes (DE, RE) performed in parallel; II) To combine the specificity of the aptamers
for their target molecules with the sensitivity of real-time nucleic acid amplification to set up an
ultrasensitive detection method based on ELONA-qPCR; III) To apply the developed ELONAqPCR
system to the functional characterization (including the quantification of the dissociation
constant, Kd, and maximum binding capacity, Bmax) of the obtained aptamers; IV) To identify short
sequence/structure motifs present in the high affinity aptamers that could be involved in the
aptamer-Ebp1 interaction; V) Finally, to perform a preliminary analysis of the three-dimensional
structure of FMDV IRES, Ebp1 and IRES-Ebp1 complexes by means of atomic force microscopy
(AFM).
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"Texto de la Tesis Doctoral"
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