Generation of enteropathogenic E. coli strains lacking the repertoire of effectors translocated by the type III protein secretion system and their characterization in the infection of cultured cell lines and human intestinal biopsies

Abstract

Although most Escherichia coli isolates are harmless commensals of the gastrointestinal tract, some strains have acquired specific virulence factors, like pathogenicity islands, insertion elements (IEs), and prophages (PPs), to become highly adapted pathogens. The enteropathogenic E. coli (EPEC) is an important category of diarrheagenic bacteria causing acute and chronic diarrhea in infants. The hallmark of EPEC infection is the formation of attachment and effacement (A/E) lesion in the intestinal mucosa surface, which is characterized by the intimate attachment of the bacteria to the enterocyte, microvilli effacement, and the formation of actin-pedestal-like structures underneath the attached bacteria. EPEC is endowed of a 35 kb pathogenicity island called the locus of enterocyte effacement (LEE) that contains all the genes necessary for the assembly of a type III secretion system (T3SS) injectisome. Through these injectisome EPEC translocates multiple effector proteins into the host cell to subvert cellular functions in benefit of the infection. The prototype strain E2348/69 of EPEC O127:H6 is endowed of six LEE encoded effectors and 17 non-LEE encoded effectors. We have engineered a set of effector mutant EPEC strains using suicide vectors to delete the whole repertoire of effector genes of this prototype EPEC strain. Genome manipulation did not affect the functionality of the T3SS injectisome. The deletion strategy was based on suicide or termosensitive plasmid integration by homologous recombination and the markerless resolution of co-integrants after I-SceI digestion. We did markerless integration of map, espH and nleC in their original locus in EPEC2 (maintain EspZ and Tir), EPEC1 (maintaining only Tir) and EPEC0 (effector-less) mutant strains. These strains were able to translocate functional effectors from chromosomal expression into HeLa cells. We infected intestinal human biopsies with the effector mutant EPEC strains to identify the effectors necessary for the induction of the A/E lesion in human intestinal tissues. We found that while EPEC2 and EPEC1 mutant strains were able to induce the actin-pedestal formation in HeLa cells in vitro, none of the biopsies infected with these strains had A/E lesion. These results demonstrated that effectors besides Tir and EspZ are essential to induce the A/E lesion formation in intestinal biopsies. We infected intestinal biopsies with several effector mutant EPEC strains and we found that effectors located outside the LEE are essential to induce efficient A/E lesion on human intestinal biopsies. Additionally we found that non-LEE effectors are characterized by having an additive effect to allow the A/E lesion development in these intestinal surfaces and that Efa1/LifA homologous proteins seem to play a major role in this process. Our results with intestinal biopsies strongly suggest that non-LEE effectors are necessary for the efficient formation of A/E lesion in the in vivo situation.

Aunque la mayoría de los aislados de Escherichia coli son comensales del tracto gastrointestinal, algunas cepas han adquirido factores de virulencia específicos, como islas de patogenicidad, elementos integrativos (IEs), y profagos (PPs), para convertirse en patógenos altamente adaptados. La cepas de Escherichia coli enteropatógena (EPEC) son una categoría importante de bacterias productoras de diarrea aguda y crónica en niños de corta edad. La característica distintiva de la infección por EPEC es la formación de la lesión llamada de unión y borrado A/E (Attaching and Effacing lesion), que se caracteriza por una unión intima de la bacteria a los enterocitos, la destrucción de las microvellosidades, y la formación de estructuras en forma de pedestales debajo de las bacterias unidas. EPEC está dotada de una isla de patogenicidad de 35 kb llamada LEE (locus of enterocyte effacement) que contiene todos los genes necesarios para ensamblar los inyectisomas del sistema de secreción tipo III (T3SS). A través de estos inyectisomas EPEC transloca proteínas efectoras a la célula huésped para manipular diversas funciones celulares en beneficio de la infección. La cepa prototipo E2348/69 de EPEC O127:H6 tiene seis efectores codificados en la isla LEE y 17 efectores codificados fuera de la isla LEE, llamados genéricamente efectores no-LEE. Hemos construido un grupo de cepas mutantes en efectores de EPEC, utilizando vectores suicidadas para delecionar el repertorio de efectores de la cepa prototipo. La manipulación genómica no afectó la funcionalidad de los inyectisomas del T3SS. La estrategia seguida se basa en el uso de plásmidos suicidas y termosensibles que se integran por recombinación homóloga, seguida de una resolución de los co-integrantes tras digestión con I-SceI, produciendo deleciones libres de marcadores. También hemos realizado una integración libre de marcas de los genes map, espH y nleC en su sitio original en el cromosoma de las cepas mutantes EPEC2 (mantiene EspZ y Tir), EPEC1 (mantiene Tir) y EPEC0 (sin efectores). Las cepas generadas son capaces de translocar desde su expresión cromosómica los efectores individuales de forma funcional a células HeLa. Infectamos biopsias intestinales humanas con las cepas de EPEC mutantes en efectores para identificar los efectores necesarios para inducir la formación de la lesión A/E en tejidos intestinales humanos. Identificamos que mientras las cepas mutantes EPEC2 y EPEC1 inducen la formación de pedestales de actina durante la infección in vitro de células HeLa, ninguna de las biopsias infectadas por estas cepas presentó lesiones A/E. Estos resultados demuestran que otros efectores además de Tir y EspZ son esenciales para inducir la formación de la lesión A/E en las biopsias intestinales. Infectamos biopsias intestinales con varias cepas de EPEC mutantes en efectores y descubrimos que los efectores localizados fuera de la isla LEE son esenciales para inducir eficientemente la lesión A/E en las biopsias intestinales humanas. Además demostramos que los efectores no-LEE se caracterizan por tener un efecto aditivo para permitir el desarrollo de la lesión A/E en estas superficies intestinales y que las proteínas homologas a Efa1/LifA parecen jugar un papel principal en este proceso. Nuestros resultados con biopsias intestinales apoyan un papel de los efectores no-LEE en la formación eficiente de la lesión A/E en la situación in vivo.