Targeted gene therapy in a mouse model of Fanconi anemia

Abstract

Fanconi anemia (FA) is an inherited disease associated with bone marrow failure (BMF) and cancer predisposition. This disease is caused by mutations in any of the 20 FANC genes that belong to a DNA repair pathway known as FA/BRCA pathway. Gene therapy (GT) approaches with autologous hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) may constitute an efficient treatment for FA patients. In fact, conventional non-targeted GT trials based on the use of lentiviral vectors are currently under development. Because the risk of insertional oncogenesis can not be completely ruled out in any of the GT trials that are at present undergoing with integrative vectors, gene-targeting approaches have been proposed as safer alternatives. These strategies are based on the use of artificial nucleases that generate double strand breaks at specific locations in the genome which can be repaired by the homologous recombination pathway of the cells. This pathway has been exploited to facilitate the integration, into specific sites of the cell genome, of donor templates harboring the gene of interest flanked by two homology arms. In this study we have conducted a gene-editing strategy aiming at the insertion of reporter and therapeutic donors into the mouse Mbs85 locus, an ortholog of the human AAVS1 safe harbor locus. In order to achieve our goal, TALE nucleases (TALEN) were nucleofected together with different donor templates carrying either the human therapeutic FANCA gene or the EGFP (Enhance Green Fluorescent Protein) reporter gene, both of which were under the regulation of a phosphoglycerate kinase (PGK) promoter. This strategy of gene editing was implemented by means of nucleofection of the TALEN and donor as DNA plasmids in Fanca-/- (FA-A) mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and also in mouse HSPCs (mHSPCs) from WT and FA-A mice. We have first demonstrated the cleavage activity of designed TALEN in the Mbs85 locus of both FA-A MEFs and mHSPCs from WT and FA-A mice. Targeted integration (TI), as well as evidence of hFANCA expression were shown in gene-edited FA-A MEFs. Moreover, evidence of phenotypic correction was demonstrated in these cells by the reversion of the characteristic hypersensitivity to mitomycin C (MMC), and also by the reduction of the MMC-induced chromosomal aberrations. Gene-editing experiments in WT and FA-A mHSPCs also allowed us to demonstrate TI in these cell types. As it was observed in FA-A MEFs, evidence of phenotypic correction was also observed in FA-A hematopoietic colonies. In these experiments, we also observed a marked toxicity of plasmid DNA nucleofection that compromised the repopulating properties of gene-edited mHSPCs in irradiated recipients. Altogether, our results demonstrate for the first time the feasibility of implementing a therapeutic targeted integration strategy in a safe harbor locus of MEFs and mouse hematopoietic progenitors from a mouse model of Fanconi anemia. Additionally, our data suggest the necessity of limiting the toxicity associated to the nucleofection of mHSPCs with the TALEN and donor as plasmid DNA in order to improve the repopulating potential of geneedited HSCs.

La anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad hereditaria caracterizada por fallo de médula ósea y predisposición a cáncer. Esta enfermedad está causada por mutaciones en cualquiera de los 20 genes FANC descubiertos hasta la actualidad que participan en una vía de reparación del ADN conocida como ruta de AF/BRCA. Las aproximaciones de terapia génica (TG) con células madre hematopoyéticas (CMHs) autólogas podrían constituir un tratamiento eficaz para los pacientes con AF. De hecho, se están desarrollando ensayos de TG convencional no dirigida basados en el uso de vectores lentivirales. Puesto que el riesgo de oncogénesis insercional no puede descartarse por completo en ninguno de los ensayos de TG llevados a cabo en la actualidad con vectores integrativos, se han propuesto nuevas aproximaciones de TG dirigida como alternativas más seguras. Estas estrategias se basan en el uso de nucleasas artificiales que generan roturas de doble cadena en localizaciones específicas del genoma que pueden ser reparadas por la ruta de recombinación homóloga de las células. Esta ruta ha sido utilizada para facilitar la integración, en sitios específicos del genoma, de construcciones donadoras que contienen el gen de interés flanqueado por dos brazos de homología. En este estudio hemos llevado a cabo una estrategia de edición génica con el objetivo de integrar genes marcadores y terapéuticos en el locus Mbs85 de ratón, ortólogo al locus seguro AAVS1 humano. Con el fin de lograr nuestro objetivo, se nucleofectaron las nucleasas TALE (TALEN) junto a diferentes construcciones donadoras que contenían el gen terapéutico humano FANCA o el gen marcador EGFP, ambos bajo la regulación del promotor de la fosfoglicerato quinasa. Esta estrategia de edición génica se realizó por medio de nucleofección de las TALEN y del donador como ADN plasmídico en fibroblastos embrionarios de ratones con AF-A (Fanca-/-) y en células madre y progenitores hematopoyéticos (CMPHs) de ratones con AFA y ratones sanos (WT). Hemos demostrado por primera vez la actividad de corte de las TALEN diseñadas para cortar el locus Mbs85 de fibroblastos embrionarios AF-A y de CMPHs de ratones con AF-A o sanos (WT). En los clones editados genéticamente de fibroblastos embrionarios AF-A se demostró integración dirigida, así como expresión de hFANCA. Asimismo, se demostró evidencia de corrección fenotípica en estas células por la reversión de su característica hipersensibilidad a mitomicina C (MMC), y también por la disminución de aberraciones cromosómicas inducidas por MMC. Los experimentos de edición génica en CMPHs de ratones con AF-A o sanos (WT) nos permitieron demostrar integración dirigida en estos tipos celulares. Tal y como fue observado en los fibroblastos embrionarios AF-A, se demostraron también evidencias de corrección fenotípica en colonias hematopoyéticas AF-A. En estos experimentos, también observamos una toxicidad acusada debida a la nucleofección de ADN plasmídico que comprometió las propiedades de repoblación de las CMPHs editadas genéticamente en receptores irradiados. En conjunto, nuestros resultados demuestran por primera vez la posibilidad de llevar a cabo una estrategia terapéutica de integración dirigida en un locus seguro de fibroblastos embrionarios y progenitores hematopoyéticos de un modelo de ratón de anemia de Fanconi. Además, nuestros datos muestran la necesidad de limitar la toxicidad asociada a la nucleofección de CMPHs con las construcciones TALEN y los donadores en forma de ADN plasmídico para mejorar el potencial de repoblación de las CMHs editadas genéticamente.