Identificación bioquímica, genética y funcional de genes implicados en la potencialidad de células germinales

Abstract

La obtención de células troncales pluripotentes inducidas ha supuesto un gran avance científico. Sin embargo, la baja eficiencia de su obtención y la falta de conocimiento acerca de los fundamentos moleculares implicados en la adquisición de pluripotencia han retrasado la aplicación de esta tecnología a la práctica clínica. Para esclarecer los mecanismos implicados en la reprogramación celular, el presente trabajo utilizó células germinales primordiales (PGCs) de ratón, que conservan una estrecha relación con la pluripotencia. En primer lugar, las PGCs expresan factores relacionados con la pluripotencia, como Oct4, Sox2, Nanog y Lin28. Además, las PGCs, que normalmente dan lugar únicamente a los gametos, son capaces de reprogramarse hacía células germinales embrionarias (EGCs), de tipo pluripotente, al ser cultivadas en presencia de bFGF o de tricostatina A. Finalmente, al ser cultivadas en condiciones de hipoxia, las PGCs dan lugar a células reprogramadas capaces de diferenciarse in vitro hacia las tres hojas embrionarias y de integrarse en mórulas en desarrollo. Sin embargo, las células generadas por exposición a hipoxia no son capaces de expandirse en cultivo, probablemente por su negatividad para Klf4 y c-Myc. Los resultados recogidos en esta tesis doctoral muestran que tanto el metabolismo energético como la autofagia o la modificación epigenética entre otros procesos, intervienen en la reprogramación de las PGCs y son capaces de inducirla mediante el uso de factores solubles. Las células obtenidas mediante el uso de estos factores reprogramadores son capaces de dar lugar a las 3 hojas embrionarias in vitro. Sin embargo, las células obtenidas son negativas para Klf4 y/o c-Myc y no pueden mantenerse en cultivo a largo plazo. La inducción de pluripotencia mediante los diversos compuestos reprogramadores converge en un pico esporádico de expresión de HIF1α y en la pérdida progresiva de la expresión de HIF2α. Además, se aprecia un mayor número de mitocondrias inactivas y una desregulación en los niveles de Oct4 dependiente de HIF. La alteración del metabolismo energético y del estado epigenético aumenta la capacidad proliferativa de las células reprogramadas, que muestran positividad para c-Myc, pero no para Klf4, y que igualmente no alcanzan la capacidad de autorrenovación indefinida. En conclusión, la reprogramación de PGCs implica una reestructuración celular, metabólica y epigenética que converge en la expresión temporal de HIF1α y en la pérdida de HIF2α, lo cual desemboca en la alteración de los niveles de Oct4 y en la reprogramación metabólica hacia un perfil glicolítico. Las células reprogramadas obtenidas no alcanzan un fenotipo reprogramado completo, ya que aunque presentan capacidad pluripotente dando lugar a células de las tres hojas embrionarias, no poseen una capacidad plena de autorrenovación.

The generation of induced pluripotent stem cells represents a major scientific breakthrough. However, the low efficiency of their derivation and the lack of understanding of the molecular pathways involved in the acquisition of pluripotency have delayed the application of this technology into clinical practice. In order to unfold the mechanisms involved in cell reprogramming, this study utilized mouse primordial germ cells (PGCs), which indirectly store pluripotency. Firstly, PGCs express transcription factors associated to pluripotency, such as Oct4, Sox2, Nanog and Lin28. Secondly, PGCs, which normally only give rise to gametes, are able to reprogram towards pluripotent embryonic germ cells (EGCs) when cultured with bFGF and trichostatin A. Also, when cultured under hypoxic conditions, PGCs reprogram into cells able to differentiate in vitro towards the three germ layers and to integrate in vivo into developing morulae. However, these hypoxiaderived cells are not able to expand indefinitely in vitro, probably because of their lack of expression of Klf4 and c-Myc. Results included in this study show that energetic metabolism, autophagy or epigenetic state among others intervene in PGCs reprogramming and are able to induce it using soluble factors. Cells derived using these reprogramming factors are able to differentiate into the three germ layers in vitro. However, these reprogrammed cells are also Klf4 and/or c-Myc-negative and cannot be maintained indefinitely in culture. Induction of pluripotency using these reprogramming factors shares some common features: a peak of expression of HIF1α and the progressive loss of HIF2α. In addition, a larger number of inactive mitochondria and a HIFdependent Oct4 levels deregulation are observed. Also, alteration of energetic metabolism and epigenetic state enhance the proliferative capacity of reprogrammed cells, which become c- Myc-positive but remain Klf4-negative and do not acquire full self-renewal capacity. In conclusion, PGCs reprogramming involves cell, metabolic and epigenetic rearrangements, which lead to temporary expression of HIF1α, loss of HIF2α, Oct4 deregulation and metabolic reprogramming towards a glycolytic profile. Reprogrammed cells do not reach a complete reprogrammed phenotype, since they do not show a full self-renewal capacity although they are able to give rise to cells of the three germ layers.