Cellular reprogramming in the adult organism and its interplay with tissue damage

Abstract

Cell identity can be genetically manipulated in such a way that differentiated cells can achieve full pluripotency in a process known as cellular reprogramming. This process has been thoroughly investigated in vitro, however, little is known regarding the effects of the activation of the reprogramming factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc or OSKM in an adult organism. To shed some light on in vivo reprogramming, we generated reprogrammable mouse lines, or i4F for inducible-four factors, which contain a doxycycline-inducible OSKM transgene. Upon activation of OSKM, epithelial cells from pancreas, stomach and intestine, suffered a process of dedifferentiation, characterized by a progressive loss of their identity, and ultimately reached full pluripotency, thereby demonstrating that cellular reprogramming is feasible in an adult organism. Moreover, i4F mice also presented circulating iPSCs in the bloodstream, which could be isolated and cultured in vitro. These in vivo-generated iPSCs, contrary to ESCs or standard in vitro-generated iPSCs, shared some transcriptional similarities to the cells of the morula or blastomeres and presented an increased ability to differentiate into extraembryonic tissues both in vitro and in vivo. Remarkably, i4F mice and in vivo iPSCs had the ability to generate ‘embryonic-like’ structures, which suggests that in vivo reprogramming leads to the acquisition of a more plastic pluripotent state that is closer to totipotency. On the other hand, we also observed that the in vivo activation of OSKM, apart from inducing reprogramming within tissues, also produces cellular damage, which in turn results in cellular senescence. These two OSKM-induced processes, reprogramming and senescence, coexist within the same tissue environment and a positive correlation was found between them. Pharmacological manipulations showed that senescent cells promote cellular reprogramming through secreted factors, being IL6 a key mediator of this crosstalk. Analyzing the role of the tumor suppressor genes Ink4a/Arf and p53 on these processes, we observed that the induction of senescence by OSKM and the secretion of IL6 require a functional Ink4a/Arf locus, as tissues deficient for Ink4a/Arf did not undergo senescence and their reprogramming ability was severely compromised. On the contrary, tissues lacking p53 suffered intense cellular damage and senescence leading to increased reprogramming. All these observations can be recapitulated in vitro. Importantly, biological contexts of increased damage and senescence, such as tissue injury or aging, promote cellular reprogramming in vivo. Altogether, these results demonstrate that cell autonomous barriers for reprogramming, such as Ink4a/Arf, damage and aging, play additional and dominant cell-extrinsic roles in promoting cellular reprogramming and this could have important implications for tissue repair and regeneration processes. !

La identidad celular puede ser manipulada genéticamente de tal modo que células diferenciadas pueden adquirir características de pluripotencia, proceso conocido como reprogramación celular. Dicho proceso ha sido ampliamente investigado in vitro, sin embargo apenas se conocen los efectos que puede tener en un organismo adulto la activación de los genes de reprogramación: Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc o OSKM. Con este propósito, hemos generado líneas de ratón reprogramables, o i4F de ‘cuatro factores inducibles’, que contienen el transgén OSKM inducible por doxiciclina. La expresión de OSKM provoca un proceso de desdiferenciación en páncreas, intestino y estómago, donde las células epiteliales pierden progresivamente su identidad, adquiriendo finalmente la pluripotencia total, lo que demuestra que la reprogramación celular es factible en un organismo adulto. Adicionalmente, los ratones i4F presentan iPSCs en el torrente sanguíneo, que pueden ser aisladas y cultivadas in vitro. Las iPSCs generadas in vivo, a diferencia de las ESCs o de las iPSCs estándar generadas in vitro, comparten algunos rasgos transcripcionales con las células en el estado de mórula o blastómeros y presentan una mayor capacidad de diferenciación a tejidos extraembrionarios tanto in vitro como in vivo. Además, los ratones i4F y las iPSCs in vivo tienen la capacidad de generar estructuras ‘pseudoembrionarias’, lo que sugiere que la reprogramación in vivo permite la adquisición de un estadio de pluripotencia con una mayor plasticidad, más cercano a la totipotencia. Por otro lado, hemos observado que la activación de OSKM in vivo, además de inducir reprogramación en los tejidos, también produce daño celular que a su vez se traduce en senescencia celular. Los dos procesos inducidos por OSKM, reprogramación y senescencia, coexisten en un mismo tejido y existe una correlación positiva entre ambos, ya que hemos observado mediante manipulaciones farmacológicas que las células senescentes promueven la reprogramación mediante la secreción de factores, y entre ellos hemos visto que IL6 juega un papel fundamental. Estudiando el papel de los supresores tumorales Ink4a/Arf y p53 sobre dichos procesos, hemos visto que inducción de senescencia por OSKM y la secreción de IL6 requieren de un locus Ink4a/Arf funcional, ya que en ausencia de dichos genes, los tejidos no tienen senescencia y su capacidad de reprogramación se ve comprometida. Por el contrario, tejidos sin p53 sufren un daño y senescencia intensos, lo que conlleva a una mayor reprogramación. Todas estas observaciones pueden recapitularse in vitro. Finalmente, situaciones caracterizadas por una acumulación de células dañadas y senescentes, como el daño tisular o el envejecimiento, promueven la reprogramación in vivo. Estos resultados demuestran que barreras para la reprogramación intrínsecas a la célula, como Ink4a/Arf, el daño o el envejecimiento, tienen papeles extrínsecos adicionales y dominantes que promueven la reprogramación celular, lo que podría tener implicaciones importantes para procesos de reparación de tejidos y regeneración.