Cellular reprogramming in the adult organism and its interplay with tissue damage
Author
Mosteiro Carretero, LlucAdvisor
Serrano Marugán, ManuelEntity
UAM. Departamento de Biología MolecularDate
2017-02-10Subjects
Citología - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 10-02-2017
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
Cell identity can be genetically manipulated in such a way that differentiated cells can achieve
full pluripotency in a process known as cellular reprogramming. This process has been
thoroughly investigated in vitro, however, little is known regarding the effects of the activation
of the reprogramming factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc or OSKM in an adult organism. To
shed some light on in vivo reprogramming, we generated reprogrammable mouse lines, or i4F
for inducible-four factors, which contain a doxycycline-inducible OSKM transgene. Upon
activation of OSKM, epithelial cells from pancreas, stomach and intestine, suffered a process of
dedifferentiation, characterized by a progressive loss of their identity, and ultimately reached
full pluripotency, thereby demonstrating that cellular reprogramming is feasible in an adult
organism. Moreover, i4F mice also presented circulating iPSCs in the bloodstream, which could
be isolated and cultured in vitro. These in vivo-generated iPSCs, contrary to ESCs or standard in
vitro-generated iPSCs, shared some transcriptional similarities to the cells of the morula or
blastomeres and presented an increased ability to differentiate into extraembryonic tissues both
in vitro and in vivo. Remarkably, i4F mice and in vivo iPSCs had the ability to generate
‘embryonic-like’ structures, which suggests that in vivo reprogramming leads to the acquisition
of a more plastic pluripotent state that is closer to totipotency.
On the other hand, we also observed that the in vivo activation of OSKM, apart from
inducing reprogramming within tissues, also produces cellular damage, which in turn results in
cellular senescence. These two OSKM-induced processes, reprogramming and senescence,
coexist within the same tissue environment and a positive correlation was found between them.
Pharmacological manipulations showed that senescent cells promote cellular reprogramming
through secreted factors, being IL6 a key mediator of this crosstalk. Analyzing the role of the
tumor suppressor genes Ink4a/Arf and p53 on these processes, we observed that the induction of
senescence by OSKM and the secretion of IL6 require a functional Ink4a/Arf locus, as tissues
deficient for Ink4a/Arf did not undergo senescence and their reprogramming ability was
severely compromised. On the contrary, tissues lacking p53 suffered intense cellular damage
and senescence leading to increased reprogramming. All these observations can be recapitulated
in vitro. Importantly, biological contexts of increased damage and senescence, such as tissue
injury or aging, promote cellular reprogramming in vivo. Altogether, these results demonstrate
that cell autonomous barriers for reprogramming, such as Ink4a/Arf, damage and aging, play
additional and dominant cell-extrinsic roles in promoting cellular reprogramming and this could
have important implications for tissue repair and regeneration processes.
! La identidad celular puede ser manipulada genéticamente de tal modo que células diferenciadas
pueden adquirir características de pluripotencia, proceso conocido como reprogramación
celular. Dicho proceso ha sido ampliamente investigado in vitro, sin embargo apenas se conocen
los efectos que puede tener en un organismo adulto la activación de los genes de
reprogramación: Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc o OSKM. Con este propósito, hemos generado
líneas de ratón reprogramables, o i4F de ‘cuatro factores inducibles’, que contienen el transgén
OSKM inducible por doxiciclina. La expresión de OSKM provoca un proceso de
desdiferenciación en páncreas, intestino y estómago, donde las células epiteliales pierden
progresivamente su identidad, adquiriendo finalmente la pluripotencia total, lo que demuestra
que la reprogramación celular es factible en un organismo adulto. Adicionalmente, los ratones
i4F presentan iPSCs en el torrente sanguíneo, que pueden ser aisladas y cultivadas in vitro. Las
iPSCs generadas in vivo, a diferencia de las ESCs o de las iPSCs estándar generadas in vitro,
comparten algunos rasgos transcripcionales con las células en el estado de mórula o blastómeros
y presentan una mayor capacidad de diferenciación a tejidos extraembrionarios tanto in vitro
como in vivo. Además, los ratones i4F y las iPSCs in vivo tienen la capacidad de generar
estructuras ‘pseudoembrionarias’, lo que sugiere que la reprogramación in vivo permite la
adquisición de un estadio de pluripotencia con una mayor plasticidad, más cercano a la
totipotencia.
Por otro lado, hemos observado que la activación de OSKM in vivo, además de inducir
reprogramación en los tejidos, también produce daño celular que a su vez se traduce en
senescencia celular. Los dos procesos inducidos por OSKM, reprogramación y senescencia,
coexisten en un mismo tejido y existe una correlación positiva entre ambos, ya que hemos
observado mediante manipulaciones farmacológicas que las células senescentes promueven la
reprogramación mediante la secreción de factores, y entre ellos hemos visto que IL6 juega un
papel fundamental. Estudiando el papel de los supresores tumorales Ink4a/Arf y p53 sobre
dichos procesos, hemos visto que inducción de senescencia por OSKM y la secreción de IL6
requieren de un locus Ink4a/Arf funcional, ya que en ausencia de dichos genes, los tejidos no
tienen senescencia y su capacidad de reprogramación se ve comprometida. Por el contrario,
tejidos sin p53 sufren un daño y senescencia intensos, lo que conlleva a una mayor
reprogramación. Todas estas observaciones pueden recapitularse in vitro. Finalmente,
situaciones caracterizadas por una acumulación de células dañadas y senescentes, como el daño
tisular o el envejecimiento, promueven la reprogramación in vivo. Estos resultados demuestran
que barreras para la reprogramación intrínsecas a la célula, como Ink4a/Arf, el daño o el
envejecimiento, tienen papeles extrínsecos adicionales y dominantes que promueven la
reprogramación celular, lo que podría tener implicaciones importantes para procesos de
reparación de tejidos y regeneración.
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