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In vivo phosphoproteomics reveals kinase activity profiles that predict treatment outcome in triple- negative breast cancer
Author
Zagorac, IvanaAdvisor
Quintela Fandiño, Miguel ÁngelEntity
UAM. Departamento de Biología Molecular; Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO)Date
2017-03-17Subjects
Mamas - Cáncer - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17-03-2017Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
Triple-negative breast cancer (TNBC) is am immunohistochemically-defined
breast cancer subtype negative for ER, PR and HER2 expression, with dismal
prognosis that lacks prognostic and predictive markers. Since all the aberrations that
exist and ultimately contribute to the tumor phenotype converge, from a functional point
of view, in the final status of the phosphorylation of the proteome in a given moment, we
sought to interrogate the phosphoproteome with two aims: 1) establish a taxonomy of
TNBC based on measurable markers that predict clinical course; 2) reduce the
phosphoproteome that characterizes the bad- from good-prognosis cases to its
targetable, driving kinases, in order to define rational therapeutic approaches in TNBC.
Therefore we performed mass-spectrometry based quantitative phosphoproteomics
from a training set of 34 frozen patient tumor samples paired by tumor size (T), nodal
status (N), and grade (G). 13 patients relapsed in less than 3 years and 21 patients
were relapse-free for more than 10 years follow up. Moreover in our study we included
ten triple-negative cell lines, 3 cell lines that killed recipient mice in less than 100 days
and 7 indolent cell lines (no death in more than 400 days). In our study we were able to
identify and quantify more than 17000 unique phosphopeptides (pPs) in the patient
samples and cell lines. Differential analysis showed that 161 pPs were up-regulated in
the relapsed vs non-relapsed group. Furthermore the hyperactivity of 11 kinases
accounted for the pPs upregulated in the relapsed group. A mass-spectrometry-toimmunohistochemistry
translation step in 113 consecutive TNBC cases, spotted in
TMAs, with 14 years follow up revealed that 6/11 kinases (PRKCE, KIT, PNKP, ERK,
CDK6 and P70S6K) preserved independent prognostic value. The kinases split the
validation set into two patterns: one (0/6 hyperactivated kinases; 29% of the patients)
associated to 93.5 % cure rate. The other (≥1 hyperactivated kinase; 37 subpatterns)
was associated to a 9.5-fold higher relapse risk. The 15 possible 2-drug combinations
targeting these kinases were synergistic in vitro and in vivo. Our results elucidate novel
phosposites/kinases implicated in TNBC and provide a ready to use, actionable targetsbased
clinical classification system for TNBC. El cáncer de mama triple negativo (TNBC) es un subtipo de cáncer de mama
definido inmunohistoquimicamente como negativo para la expresión de ER, PR y
HER2, además carece de marcadores pronósticos y predictivos lo que hace que
presente un mal pronóstico en general. Dado que todas las aberraciones genómicas
presentes en el tumor contribuyen en el fenotipo tumoral y convergen, desde un punto
de vista funcional, en el estado final de la fosforilación del proteoma en un momento
dado, se intentó interrogar al fosfoproteoma con dos objetivos: 1) establecer una
taxonomía de TNBC basado en marcadores medibles capaces de predecir el curso
clínico; 2) simplificar el fosfoproteoma que distingue a pacientes con peor y mejor
pronóstico llevado a cabo por las quinasas, con el fin de definir distintos enfoques
terapéuticos en el TNBC. Por lo tanto hemos realizado un ánalisis fosfoproteómico
cuantitativo, por espectrómetría de masas en un grupo de 34 muestras de pacientes,
agrupadas por grado (G), tamaño del tumor (T) y estado de los ganglios (N). 13 de los
pacientes recayeron en menos de 3 años y los otros 21 no presentaron recaida en más
de 10 años de seguimiento. Además en nuestro estudio se incluyeron diez líneas
celurares triple negativas. La inyeccion de 3 de estas líneas celurares en ratones
receptores fueron capaces de matarlos en menos de 100 días considerándose líneas
agresivas, mientras que las 7 líneas celulares restantes no fueron capaces de matar a
los ratones receptores en mas de 400 días y por ello se consideraron no agresivas. En
nuestro estudio hemos podido identificar y cuantificar más de 17000 fosfopeptidos
únicos, (pPs) presentes en las muestras de pacientes y líneas celulares. El análisis
diferencial demostró que 161 de estos pPs idetificados estaban hiperregulados en el
grupo de pacientes que recaían comparados con el grupo de pacientes sin recaída.
Además, se identificaron 11 kinasas hiperactivas responsables de la hiperregulación de
estos pPs, en el grupo de los pacientes que recaian. La validación de los resultados
obtenidos mediante espectrometría de masas se llevo a cabo en una neuva seríe de
113 muestras de casos de TNBC (con 14 años de seguimiento) que fueron incluidos
en TMAs. Mediante técnicas inmunohistoquímicas observamos que 6 de las 11 kinasas
identificadas (PRKCE, KIT, PNKP, ERK, CDK6 y P70S6K) conservaban un valor
pronóstico independiente. Estas 6 kinasas son capaces de dividir el grupo de validación
en dos patrones: uno asociado a la tasa de curación del 93,5% (0/6 kinasas
hiperactivadas; 29% de los pacientes) y el otro asociado a un mayor riesgo de recaida
9.5-veces (≥1 kinasas hiperactivadas; 37 sub-patrones). El tratamiento con las 15
posibles combinaciones de 2 fármacos dirigidos contra estas kinasas, fueron
sinergisticas en tratamientos vitro y en vivo. Nuestros resultados identifican nuevos
sitios de fosforilación y kinasas implicadas en el cáncer de mama triple negativo,
proporcionando un nuevo sistema de clasificación basado en estos marcadores y que
podría ser utilizado en la práctica clínica.
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