Cell death, cell growth and cell cycle regulation by the Retinoblastoma family
Author
Chiodo, YuriEntity
UAM. Departamento de Bioquímica; Instituto de Investigaciones Biomédicas "Alberto Sols" (IIBM); Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC)Date
2017-06-02Subjects
Retinoblastoma - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 2-06-2017Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 02-12-2018
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
The Retinoblastoma gene (RB1) was the first tumor suppressor gene to be
cloned. Its encoded protein, the Retinoblastoma protein (pRB) is a member of the
Retinoblastoma family, which is constituted also by p107 and p130. This family plays a
critical role in the control of the progression through the different phases of the cell
cycle. pRB is particularly involved in the G1-to-S transition and, although its role in cell
cycle regulation is well defined, its role in the regulation of cell death remains
controversial. In this work, we have performed a systematic and global study of the
Retinoblastoma family members and of the various functional domains of pRB in the
regulation of E2F activity, cell cycle progression, DNA replication, and in the regulation
of cell death triggered by ionizing radiation (IR). While all family members inhibited E2F
activity and DNA replication, and accumulated cells in G0/G1 in the short-term, pRB
was the only member of the family that inhibited IR-induced cell death and arrested
cells in the G0/G1 cell cycle phase in the long-term. We have found a strong
correlation between the capacity of pRB to induce a long-term arrest of the cell cycle
and its capacity to inhibit cell death, suggesting that a sustained arrest of the cell cycle
in G0/G1 is necessary and sufficient to inhibit cell death caused by DNA damage.
These data suggest that pRB may not play a direct role in the regulation of cell death
induced by DNA damage and that cell survival might be the consequence of its main
function, the arrest of the cell cycle until DNA damage has been eliminated. We have
forced the expression of various domains of pRB and the results obtained strongly
suggest that a correct folding of pRB, integrating its small pocket and carboxyl terminus
into the large pocket, is critically required to efficiently inhibit IR-induced cell death and
to block cell cycle progression in the long-term. Finally, we have created in-silico a 3-
dimensional model of full-length pRB that shows the presence of an amino acid from
the carboxyl terminus (R798) in the soil of the pocket, next to an amino acid from the
A-domain (K530). The analysis of the conformational changes induced by inactivating
mutations in the A- or in the B-domain showed that the carboxyl terminus was more
severely affected than the small pocket. The in-silico analysis therefore supports the
notion that the functional pRB large pocket is the result of the structural integration of
the small pocket and the carboxyl terminus. El gen Retinoblastoma (RB1) fue el primer gen supresor de tumores clonado y
codifica la proteína Retinoblastoma (pRB). Esta proteína es el miembro fundador de la
familia Retinoblastoma, que también está constituida por p107 y p130. Esta familia juega
un papel crítico en el control de la progresión a través de las diferentes fases del ciclo
celular. pRB está particularmente implicado en la transición de G1 a S y, aunque su papel
en la regulación del ciclo celular está bien definido, su papel en la regulación de la muerte
celular sigue siendo controvertida. En este trabajo hemos realizado un estudio sistemático
y global de los miembros de la familia de Retinoblastoma y de los diferentes dominios
funcionales de pRB en la regulación de la actividad de E2F, la progresión del ciclo celular,
la replicación del ADN y en la regulación de la muerte celular provocada por la radiación
ionizante (IR). Mientras que todos los miembros de la familia Retinoblastoma inhibieron la
actividad de E2F y la replicación del ADN, y favorecieron la acumulación de las células en
G0/G1 a corto plazo, pRB fue el único miembro de la familia que inhibió la muerte celular
inducida por IR y detuvo las células en la fase G0/G1 a largo plazo. Hemos encontrado
una fuerte correlación entre la capacidad de pRB para inducir una detención a largo plazo
del ciclo celular y su capacidad para inhibir la muerte celular, lo que sugiere que una
detención sostenida del ciclo celular en G0/G1 es necesaria y suficiente para inhibir la
muerte celular causada por daño del ADN. Estos datos sugieren que pRB no desempeña
un papel directo en la regulación de la muerte celular inducida por daño del ADN y que la
supervivencia celular sería la consecuencia de su función principal, la detención del ciclo
celular hasta que el daño del ADN ha sido eliminado. Hemos forzado la expresión de
diversos dominios de pRB y los resultados obtenidos sugieren fuertemente que un
plegamiento de pRB que permita la integración del dominio llamado bolsillo pequeño con
la región carboxilo terminal es esencial para inhibir eficientemente la muerte celular
inducida por IR y para bloquear la progresión del ciclo celular a largo plazo. Por último,
hemos creado in silico un modelo tridimensional de pRB completa que muestra la
presencia de un aminoácido del extremo carboxilo (R798) en el suelo del bolsillo, junto a
un aminoácido del dominio A (K530). El análisis de los cambios conformacionales
inducidos por mutaciones inactivadoras en el dominio A o en el dominio B mostró que el
extremo carboxilo estaba más gravemente afectado que el bolsillo pequeño. El análisis in
silico por lo tanto apoya la noción de que el denominado bolsillo grande de pRB es el
resultado de la integración estructural del bolsillo pequeño con el dominio carboxilo
terminal. En conjunto, nuestros datos sugieren que esta integración estructural podría dar
lugar a la formación de un dominio funcional en pRB necesario para la parada sostenida
del ciclo celular y la inhibición de muerte que no estaría presente en p107 y p130.
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