Transportador de glicina GLYT2: localización subcelular, asociación con balsas lipídicas y biogénesis
Author
Alonso Torres, PabloAdvisor
López Corcuera, BeatrizEntity
UAM. Departamento de Biología MolecularDate
2017-09-15Subjects
Glicina - Tesis doctorales; Neurotransmisores - Tesis doctoralesNeurotransmisores - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 15-09-2017Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
La glicina actúa como neurotransmisor inhibidor en áreas caudales del sistema nervioso central
de vertebrados y está implicada en el procesamiento de la información sensorial y motora. La
retirada de la glicina sináptica se realiza por proteínas transportadoras que la incorporan a la
célula junto con iones sodio y cloruro. GlyT2, el transportador presente en la membrana
plasmática de neuronas presinápticas, se ocupa de suministrar glicina al terminal glicinérgico y
de reciclar el neurotransmisor sináptico para su inclusión en las vesículas de secreción. Su
función es necesaria para el correcto funcionamiento de la neurotransmisión glicinérgica. Se han
identificado mutaciones en el gen humano de GlyT2 como causantes de un desorden
neurológico denominado hiperplexia o “enfermedad del sobresalto”, caracterizado por
respuestas exageradas ante estímulos triviales, táctiles o auditivos, y alteraciones respiratorias.
GlyT2 es también una proteína relevante en el procesamiento de la información nociceptiva. En
esta Tesis doctoral se ha llevado a cabo un análisis de la localización subcelular del
transportador, a partir de sinaptosomas de tallo cerebral de rata, mediante técnicas bioquímicas
e inmunológicas que han identificado la naturaleza de las vesículas intracelulares de GlyT2. El
transportador se encuentra en vesículas grandes y pequeñas donde co-localiza con sinaptofisina,
Rab11 y, en las más grandes, también con VIAAT. Rab5A, GAT1, sinaptotagmina2 y VAMP2 no
se asocian a vesículas de GlyT2. Se ha demostrado la regulación funcional del tráfico de GlyT2
por la GTPasa Rab11 que está presente en vesículas endosomales que contienen GlyT2.
Por otro lado, mediante fraccionamiento de las membranas de tallo cerebral esta Tesis
demuestra que GlyT2 está asociado a balsas lipídicas y que su actividad se regula de manera
reversible por los niveles de colesterol y esfingolípidos en la membrana.
Adicionalmente se ha realizado un estudio en células en cultivo mediante marcaje metabólico e
inmunoprecipitación del transportador expresado para analizar los requerimientos de la
biogénesis de GlyT2. Este estudio constituye un marco adecuado para facilitar el progreso a la
membrana de mutantes de hiperplexia. Se ha comprobado que GlyT2 se sintetiza como
precursor inmaduro con N-glicosilación incompleta que da lugar a la forma de mayor tamaño
presente en superficie que contiene glicanos en cuatro asparaginas de EL2. La N-glicosilación
estabiliza el plegamiento de GlyT2 y condiciona la distribución asimétrica en células MDCK. En
el RE, GlyT2 es asistido en su biogénesis por la chaperona CNX. Mediante mutagénesis de los
sitios de glicosilación y herramientas farmacológicas hemos demostrado que la unión a CNX
depende del número y posición de los azúcares del transportador, así como de interacciones
proteína-proteína. La expresión de GlyT2 y su actividad de transporte se atenúan al reducir la
expresión de CNX mediante un ARNi específico de la chaperona. Finalmente, se han investigado
las vías de degradación del transportador que puede degradarse vía proteasoma,
posiblemente mediado por ERAD, aunque la degradación del transportador de
membrana plasmática es sobre todo lisosomal. Glycine acts as an inhibitory neurotransmitter in caudal areas of the central nervous system of
vertebrates and is involved in the processing of sensory and motor information. The removal of
the synaptic glycine is performed by transporter proteins that reuptake the transmitter into the
cell along with sodium and chloride ions. GlyT2, the presynaptic neuronal transporter, is
responsible for delivering glycine to the glycinergic terminal and for recycling the synaptic
neurotransmitter for inclusion in the secretory vesicles. Its function is necessary for the proper
functioning of glycinergic neurotransmission. Mutations in the human GlyT2 gene have been
identified as causing a neurological disorder called hyperekplexia or "startle disease",
characterized by exaggerated responses to trivial, tactile or auditory stimuli, and respiratory
disturbances. GlyT2 is also a relevant protein in the processing of nociceptive information. In
this Doctoral Thesis an analysis of the subcellular localization of the transporter from rat cerebral
stem synaptosomes, has been carried out using biochemical and immunological techniques that
have identified the nature of the intracellular vesicles of GlyT2. The transporter is found in large
and small vesicles where it co-localizes with synaptophysin, Rab11 and, in larger ones, also with
VIAAT. Rab5A, GAT1, synaptotagmin2 and VAMP2 are not associated with GlyT2 vesicles.
Functional regulation of the traffic of GlyT2 by the small GTPase Rab11, present in endosomal
vesicles containing GlyT2, has been demonstrated.
On the other hand, by means of fractionation of brain stem membranes we have demonstrated
that GlyT2 is associated with lipid rafts and that glycine transport activity is reversibly regulated
by the levels of cholesterol and sphingolipids in the membrane.
In addition, a study in cells in culture was carried out by metabolic labeling and
immunoprecipitation of the expressed transporter to analyze the requirements of GlyT2
biogenesis. This study provides an adequate framework to facilitate progress to the membrane
of hyperekplexia mutants. GlyT2 has been shown to be synthesized as an immature precursor
with incomplete N-glycosylation resulting in the larger surface form containing glycans in four
EL2 asparagines. N-glycosylation stabilizes the folding of GlyT2 and conditions the asymmetric
distribution in MDCK cells. In the RE, GlyT2 is assisted in its biogenesis by the chaperone CNX.
By mutagenesis of the glycosylation sites and pharmacological tools we have shown that CNX
binding depends on the number and position of the transporter sugars as well as protein-protein
interactions. Expression of GlyT2 and its transport activity are attenuated by reducing the
expression of CNX by a specific RNAi of the chaperone. Finally, the degradation pathways of the
transporter have been investigated. It can be degraded via the proteasome, possibly mediated
by ERAD, although the degradation of the plasma membrane transporter is mainly lysosomal.
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