Magnetic Tweezers. Applications to the study of DNA-protein interactions in DNA replication, condensation, and segregation
Author
López Pastrana, CésarAdvisor
Moreno Herrero, FernandoEntity
UAM. Departamento de Física de la Materia CondensadaDate
2017-11-24Subjects
Moléculas - Tesis doctorales; ADN - Tesis doctorales; Proteínas - Tesis doctorales; FísicaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Física de la Materia Condensada . Fecha de lectura: 24-11-2017
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
Magnetic tweezers (MT) is a single molecule technique capable of applying forces and torque
to individual DNA molecules. Its simple design and its ability to obtain measurements from
di erent molecules in parallel have positioned MT among the most powerful force spectroscopy
techniques. The applications of MT span from DNA mechanics and topology to
the study of biomolecular interactions. This dissertation presents a complete description of
MT, with emphasis in the methods and procedures for its application to study DNA-protein
interactions. We have used MT to investigate two di erent biological systems in the context
of the organization and replication of the bacterial genome.
In a rst project, a novel condensation activity of the B. subtilis protein ParB is studied.
ParB proteins bind parS sequences and recruit accessory proteins to coordinate bacterial
chromosome segregation during cell division. Surprisingly, we nd a highly non-speci c
DNA binding mode independent on the parS sequence and leading to non-organized DNAprotein
complexes. The non-speci c mode of binding results in DNA condensation at permissive
forces below 2 pN. Our results indicate that condensation is the result of bridging
between distant DNA regions, as reported by the stabilization of juxtaposed DNA molecules
in cis and in trans.
We studied the implications of the ParB C-terminal domain (CTD) dimerization in DNA
binding and condensation, nding a novel DNA binding site at the aforementioned domain.
Interestingly, DNA condensation is impaired when ParB is co-incubated with the CTD. The
inhibitory activity of ParB condensation by the CTD remains unaltered by mutations at the
non-speci c binding site of the CTD nor under ionic conditions preventing non-speci c binding.
Therefore, these results evidence the dependency of CTD dimerization for the condensation
activity of ParB.
In a second project, we studied the topological and mechanical determinants of RepC nicking
activity. The protein RepC is the initiator of the rolling-circle replication in the pT181
plasmid family. RepC nicks the DNA near the origin of replication at regions presumably
forming cruciform structures. We analyzed the nicking and religation activities of RepC in
torsionally-constrained molecules. We found that RepC nicks negatively supercoiled DNA
and presents an ine cient religation activity after nicking. Remarkably, the nicking activity
is force and twist dependent. We characterized the nicking activity as a result of the
supercoiling degree and stretching force, nding results consistent with the formation of a
cruciform structure. Nonetheless, contrary to previously proposed models, our data suggest
a passive role of RepC in the extrusion of the cruciform. Based on homology modelling and
our single-molecule experiments we propose a model for the RepC nicking activity dependent
on the extrusion of a cruciform as a result of DNA supercoiling.
The results presented in this thesis help to understand the organization of the bacterial
chromosome and the topological implications for the initiation of the replication in bacterial
plasmids. Las Pinzas Magnéticas (PM) son una técnica de molécula única con capacidad para aplicar
fuerzas y torque a moléculas individuales de ADN. Su diseño simple y su capacidad para
obtener medidas en paralelo las ha posicionado entre las técnicas más potentes de espectroscopía
de fuerzas. Las aplicaciones de las PM abarcan desde mecánica y topología del ADN al
estudio de interacciones biomoleculares. Esta disertación presenta una descripción completa
de las PM, con un énfasis en los métodos y los procedimientos para su aplicación al estudio
de las interacciones entre ADN y proteínas. Hemos usado PM para investigar dos sistemas
biológicos en el contexto de la organización y la replicación del genoma bacteriano.
En un primer proyecto, se estudió una novedosa actividad condensadora de la proteína
ParB de B. subtilis. Las proteínas ParB se unen a las secuencias parS y reclutan proteínas
accesorias para coordinar la segregación del cromosoma durante la división celular. Sorprendentemente,
encontramos un modo de unión altamente no especí co independiente de
la secuencia parS dando lugar a complejos ADN-proteína no ordenados. El modo de unión
no especí co desencadena en condensación del ADN para fuerzas menores a 2 pN. Nuestros
resultados indican que la condensación es el resultado del anclaje entre regiones distantes del
ADN debido a interacciones proteína-proteína, indicado por la estabilización de moléculas
de ADN yuxtapuestas en cis y en trans.
También estudiamos las implicaciones del dominio de dimerización C-terminal (DCT) en
las actividades de unión a ADN y condensación, y encontramos un nuevo dominio de unión
a ADN en dicho dominio. Es interesante notar que la condensación de ParB se inhibe en
presencia del DCT. La actividad inhibitoria del DCT sobre la actividad de ParB no se ve
alterada por mutaciones en el sitio de unión no especí co del DCT ni por condiciones iónicas
que previenen este tipo de unión. Por tanto, estos resultados evidencian la dependencia de
la dimerización para la actividad condensadora de ParB.
En un segundo proyecto, estudiamos los determinantes topológicos y mecánicos de la actividad
de corte de RepC. La proteína RepC es responsable de la iniciación de la replicación
por círculo rodante en la familia de plásmidos pT181. RepC corta en hebra simple en una
región del ADN cerca del origen de replicación, región que presumiblemente forma estructuras
cruciformes. Analizamos las actividades de corte y de religación de RepC en moléculas
torsionalmente constreñidas. Encontramos que RepC corta ADN negativamente superenrollado
y presenta una baja actividad de religación del corte. Además la actividad del corte
es dependiente del grado de superenrollamiento y de la torsión. Caracterizamos dicha actividad
en función del grado de superenrollamiento y de la fuerza, encontrando resultados
consistentes con la formación de una estructura cruciforme. No obstante, al contrario que en
otros modelos propuestos, nuestros datos sugieren un papel pasivo de RepC en la extrusión
de la estructura cruciforme. Basándonos en nuestros datos de PM y en modelos de homología,
proponemos un modelo para la actividad de corte de RepC debido a la extrusión de una
estructura cruciforme como resultado del superenrollamiento del ADN.
Los resultados presentados en esta tesis ayudan a comprender la organización del cromosoma
bacteriano y las implicaciones topológicas en la iniciación de la replicación de plásmidos
bacterianos.
Files in this item
Google Scholar:López Pastrana, César
This item appears in the following Collection(s)
Related items
Showing items related by title, author, creator and subject.
-
Magnetic Tweezers and Fluorescence to study DNA: protein interactions
Madariaga Marcos, Julene
2019-02-22 -
Optical and magnetic tweezers for applications in single-molecule biophysics and nanotechnology
Gollnick, Benjamin
2015-01-22