Magnetic Tweezers. Applications to the study of DNA-protein interactions in DNA replication, condensation, and segregation

Abstract

Magnetic tweezers (MT) is a single molecule technique capable of applying forces and torque to individual DNA molecules. Its simple design and its ability to obtain measurements from di erent molecules in parallel have positioned MT among the most powerful force spectroscopy techniques. The applications of MT span from DNA mechanics and topology to the study of biomolecular interactions. This dissertation presents a complete description of MT, with emphasis in the methods and procedures for its application to study DNA-protein interactions. We have used MT to investigate two di erent biological systems in the context of the organization and replication of the bacterial genome. In a rst project, a novel condensation activity of the B. subtilis protein ParB is studied. ParB proteins bind parS sequences and recruit accessory proteins to coordinate bacterial chromosome segregation during cell division. Surprisingly, we nd a highly non-speci c DNA binding mode independent on the parS sequence and leading to non-organized DNAprotein complexes. The non-speci c mode of binding results in DNA condensation at permissive forces below 2 pN. Our results indicate that condensation is the result of bridging between distant DNA regions, as reported by the stabilization of juxtaposed DNA molecules in cis and in trans. We studied the implications of the ParB C-terminal domain (CTD) dimerization in DNA binding and condensation, nding a novel DNA binding site at the aforementioned domain. Interestingly, DNA condensation is impaired when ParB is co-incubated with the CTD. The inhibitory activity of ParB condensation by the CTD remains unaltered by mutations at the non-speci c binding site of the CTD nor under ionic conditions preventing non-speci c binding. Therefore, these results evidence the dependency of CTD dimerization for the condensation activity of ParB. In a second project, we studied the topological and mechanical determinants of RepC nicking activity. The protein RepC is the initiator of the rolling-circle replication in the pT181 plasmid family. RepC nicks the DNA near the origin of replication at regions presumably forming cruciform structures. We analyzed the nicking and religation activities of RepC in torsionally-constrained molecules. We found that RepC nicks negatively supercoiled DNA and presents an ine cient religation activity after nicking. Remarkably, the nicking activity is force and twist dependent. We characterized the nicking activity as a result of the supercoiling degree and stretching force, nding results consistent with the formation of a cruciform structure. Nonetheless, contrary to previously proposed models, our data suggest a passive role of RepC in the extrusion of the cruciform. Based on homology modelling and our single-molecule experiments we propose a model for the RepC nicking activity dependent on the extrusion of a cruciform as a result of DNA supercoiling. The results presented in this thesis help to understand the organization of the bacterial chromosome and the topological implications for the initiation of the replication in bacterial plasmids.

Las Pinzas Magnéticas (PM) son una técnica de molécula única con capacidad para aplicar fuerzas y torque a moléculas individuales de ADN. Su diseño simple y su capacidad para obtener medidas en paralelo las ha posicionado entre las técnicas más potentes de espectroscopía de fuerzas. Las aplicaciones de las PM abarcan desde mecánica y topología del ADN al estudio de interacciones biomoleculares. Esta disertación presenta una descripción completa de las PM, con un énfasis en los métodos y los procedimientos para su aplicación al estudio de las interacciones entre ADN y proteínas. Hemos usado PM para investigar dos sistemas biológicos en el contexto de la organización y la replicación del genoma bacteriano. En un primer proyecto, se estudió una novedosa actividad condensadora de la proteína ParB de B. subtilis. Las proteínas ParB se unen a las secuencias parS y reclutan proteínas accesorias para coordinar la segregación del cromosoma durante la división celular. Sorprendentemente, encontramos un modo de unión altamente no especí co independiente de la secuencia parS dando lugar a complejos ADN-proteína no ordenados. El modo de unión no especí co desencadena en condensación del ADN para fuerzas menores a 2 pN. Nuestros resultados indican que la condensación es el resultado del anclaje entre regiones distantes del ADN debido a interacciones proteína-proteína, indicado por la estabilización de moléculas de ADN yuxtapuestas en cis y en trans. También estudiamos las implicaciones del dominio de dimerización C-terminal (DCT) en las actividades de unión a ADN y condensación, y encontramos un nuevo dominio de unión a ADN en dicho dominio. Es interesante notar que la condensación de ParB se inhibe en presencia del DCT. La actividad inhibitoria del DCT sobre la actividad de ParB no se ve alterada por mutaciones en el sitio de unión no especí co del DCT ni por condiciones iónicas que previenen este tipo de unión. Por tanto, estos resultados evidencian la dependencia de la dimerización para la actividad condensadora de ParB. En un segundo proyecto, estudiamos los determinantes topológicos y mecánicos de la actividad de corte de RepC. La proteína RepC es responsable de la iniciación de la replicación por círculo rodante en la familia de plásmidos pT181. RepC corta en hebra simple en una región del ADN cerca del origen de replicación, región que presumiblemente forma estructuras cruciformes. Analizamos las actividades de corte y de religación de RepC en moléculas torsionalmente constreñidas. Encontramos que RepC corta ADN negativamente superenrollado y presenta una baja actividad de religación del corte. Además la actividad del corte es dependiente del grado de superenrollamiento y de la torsión. Caracterizamos dicha actividad en función del grado de superenrollamiento y de la fuerza, encontrando resultados consistentes con la formación de una estructura cruciforme. No obstante, al contrario que en otros modelos propuestos, nuestros datos sugieren un papel pasivo de RepC en la extrusión de la estructura cruciforme. Basándonos en nuestros datos de PM y en modelos de homología, proponemos un modelo para la actividad de corte de RepC debido a la extrusión de una estructura cruciforme como resultado del superenrollamiento del ADN. Los resultados presentados en esta tesis ayudan a comprender la organización del cromosoma bacteriano y las implicaciones topológicas en la iniciación de la replicación de plásmidos bacterianos.