Estudio de los efectos de la aplicación de un campo magnético alterno sobre células cargadas con nanopartículas magnéticas de óxido de hierro utilizando diferentes aproximaciones experimentales
Author
Hernández Flores, PatriciaAdvisor
Barber Castaño, Domingo F.Entity
UAM. Departamento de Biología Molecular; CSIC. Centro Nacional de Biotecnología (CNB)Date
2018-05-28Funded by
La realización de esta tesis doctoral ha sido posible gracias a los proyectos SAF2014-54057-R, otorgado por el Ministerio de Economía y Competitividad y SAF2017- 82223-R, otorgado por el Ministerio de Economía, Industria y Competitividad.Subjects
Células cancerosas - Tesis doctorales; Magnetismo - Tesis doctorales; Nanotecnología - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 28-05-2018Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 28-11-2019
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
La hipertermia magnética (MHT, del inglés magnetic hyperthermia) consiste en aumentar
selectivamente la temperatura de tejidos tumorales previamente cargados con
nanopartículas magnéticas (MNP, del inglés magnetic nanoparticles) capaces de liberar calor
en respuesta a la aplicación de un campo magnético alterno (AMF, del inglés alternating
magnetic field) en el rango de la radiofrecuencia. A pesar de la amplia investigación realizada
en el campo, no hay un consenso unánime acerca del mecanismo desencadenante de los
efectos inducidos por este tipo de tratamiento a nivel celular.
Para estudiar si los efectos mediados por MNP localizadas intracelularmente y
expuestas a un AMF son causados por la disipación de calor o se producen por mecanismos
independientes del calor, realizamos experimentos in vitro de MHT utilizando células
Pan02 y MNP de diferentes tamaños de núcleo (6 nm, 8 nm o 14 nm) recubiertas con
aminopropilsilano (APS-MNP). Suspendidas en agua, estas MNP producían cantidades
crecientes de calor en presencia de un AMF de 250 kHz y 25 kA/m (medido según el voltaje
pico-pico). A pesar de su distinta capacidad para producir calor, los tres tamaños de MNP
redujeron la viabilidad celular de una forma similar. La comparación de los niveles del
mRNA de Hsp70 (aumentada en condiciones de estrés, incluido el estrés por calor) mostró
una expresión aumentada no solo por las células cargadas con las MNP, sino también por
las muestras control expuestas del mismo modo al AMF pero no cargadas con las MNP.
Este resultado nos permitió advertir que la propia bobina generadora del AMF suponía una
fuente externa de calor. Para estudiar el efecto real de la exposición al AMF, realizamos
unos ajustes en el equipo generador del AMF con el fin de controlar la temperatura del
medio de cultivo durante su aplicación. Posteriormente, repetimos los experimentos in vitro
de MHT, en este caso con las APS-14 nm-MNP, o con MNP del mismo tamaño, pero
recubiertas con ácido dimercaptosuccínico (DMSA), y utilizando tres aproximaciones
experimentales diferentes. Para analizar el efecto del empaquetamiento de las MNP en el
interior celular, realizamos los experimentos con las MNP localizadas bien
intracelularmente (células Pan02) o bien en la membrana celular (células Jurkat) y
manteniendo la temperatura del medio de cultivo a 37 ºC; y para estudiar el efecto
cooperativo del calor externo, mantuvimos la temperatura del medio de cultivo a 41 ºC,
43 ºC o 45 ºC y con las MNP localizadas intracelularmente. En estas nuevas condiciones
experimentales no se reprodujeron ninguno de los efectos observados previamente. Por
último, analizamos las propiedades magnéticas de las MNP en los diferentes entornos
celulares estudiados anteriormente y observamos que el contacto de las MNP con las
células condujo a su agregación, influyendo en su respuesta magnética. Estos resultados
podrían explicar en parte la ausencia de efectos a nivel celular en los experimentos in vitro
de MHT en las condiciones experimentales llevadas a cabo en esta tesis doctoral. Magnetic hyperthermia (MHT) is the selective temperature increase in tumour
tissues preloaded with magnetic nanoparticles (MNP) that are able to release heat in
response to the application of an alternating magnetic field (AMF) in the radiofrequency
range. Despite much research, there is no consensus about the mechanism as to how this
treatment causes effects in cells.
To test whether the effects mediated by intracellular MNP exposed to an AMF are
caused by heat dissipated by the MNP or by heat-independent mechanisms, in vitro MHT
experiments were carried out on Pan02 cells loaded with aminopropylsilane-coated MNP
(APS-MNP) with different core sizes (6 nm, 8 nm or 14 nm). Dispersed in water, these
MNP produce increasing amounts of heat in the presence of an AMF (250 kHz, 25 kA/m
(measured according to peak-to-peak voltage)). Despite their different heat-producing
abilities, all three MNP reduced cell viability similarly. Comparison of mRNA Hsp70
expression levels (increased in stress conditions, including heat stress) showed an increased
expression not only in MNP-loaded cells but also in non-loaded control samples when
exposed to the AMF. This result lead to the fact that the coil that was used to generate the
AMF was an external heat source itself. To study the real effect of the exposure to the
AMF, some adjustments were made in the AMF applicator so as to control the culture
medium temperature during the application of the AMF. The in vitro MHT experiments
were subsequently repeated, now with the APS-14 nm-MNP, or with MNP of the same
size but coated with dimercaptosuccinic acid (DMSA), and using three different
experimental approaches. To analyze the effect of MNP confinement inside the cells, MHT
experiments were carried out with the MNP located either inside the cells (Pan02 cells) or
in the cell membrane (Jurkat cells) and maintaining the culture medium temperature at
37ºC; and to study the cooperative effect of external heat, the culture medium temperature
was maintained at 41ºC, 43ºC or 45ºC with the MNP located inside the cells. In the
conditions of these new experimental settings, none of the previously observed effects were
found. Finally, the magnetic properties of the MNP in the previously studied cellular
environments were studied and it was observed that the simple fact of being in contact with
the cells makes the nanoparticles aggregate, which affects their magnetic response. These
results may explain the absence of effects at the cellular level in the in vitro MHT
experiments in the experimental conditions carried out in this doctoral thesis.
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