Magnetic Tweezers and Fluorescence to study DNA: protein interactions
Author
Madariaga Marcos, JuleneAdvisor
Moreno Herrero, FernandoEntity
UAM. Departamento de Física de la Materia CondensadaDate
2019-02-22Funded by
Esta tesis ha sido financiada por el Gobierno Vasco a través del programa predoctoral PREDOC del Ministerio de Educación, Política Lingüística y Cultura / Dirección de Política Científica, (ref. PRE_2013_11_1174 y por el proyecto europeo del European Research Council (ERC) Mechan-Of-Chromo (ref. 681299). La estancia en el laboratorio del Prof. Dr. Ralf Seidel fue realizada gracias al programa EGONLABUR del Gobierno Vasco (ref. EP_2017_1_0015)Subjects
ADN - Tesis doctorales; Biotecnología - Tesis doctorales; Nanotecnología - Tesis doctorales; FísicaNote
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Física la Materia Condensada y Nanotecnología. Fecha de lectura: 22-02-2019Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 22-08-2021
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
The last decade has witnessed howinstrumental development has pushed the limits of singlemolecule
biophysics. An e ort has been made in combining force spectroscopy and uorescence
microscopy giving rise to a range of sophisticated setups that permit manipulating
biomolecules at the same time they can be visualized by tagging them with uorophores.
In this thesis, we have combined Magnetic Tweezers and Total Internal Re ection Fluorescence
(TIRF) microscopy. This combination resulted in a system that allows applying a controlled
force over several DNA molecules while their interactions with uorescently labelled
proteins are simultaneously visualized. This dissertation provides descriptions of both techniques,
as well as details on the design, construction and characterization experiments of
such a hybrid setup. Our apparatus has also incorporated multistream laminar ow technology
for a precise fast exchange of reagents in the sample.
The setup has been applied to the study of the binding and condensation mechanisms of
the protein ParB from Bacillus subtilis. ParB is involved in the segregation apparatus of low
copy number plasmids and it is a model for chromosome segregation in many bacteria. Although
its role in DNA condensation by network formation mechanism has been previously
described, its binding mechanism remained elusive. This thesis has contributed to understand
its DNA binding as well as the role of the C-terminal domain (CTD) of the protein
in DNA condensation inhibition. Our novel experimental approach evidenced the dynamic
nature of ParB showing a fast exchange between DNA-bound ParB and protein in the surrounding
media. Additionally, our study of the e ect of the CTD of ParB in binding and
condensation allowed us to validate a model in which the CTD of ParB blocks ParB network
formation by heterodimerization with the full-length protein, which remains bound to the
DNA.
A similar combined setup has been applied to the study of Cascade from Streptococcus
thermophilus under the supervision of Prof. Dr. Ralf Seidel at Universität Leipzig, during a
three-month predoctoral internship. The CRISPR-Cas systems are RNA-protein ribonucleoprotein
complexes that constitute an adaptative immunity system which protects prokaryotes
from foreign nucleic acids. The dynamics of the so-called R-loop formation has been
studied at the single-molecule level, but the experimental approach lacked a characterization
on protein binding or conformational changes prior to R-loop formation. In the present research
work we aim to obtain correlated Magnetic Tweezers and uorescence data to provide
insight in the binding mechanism of Cascade. Although preliminary, results presented here
helped towards the obtention of correlated measurements, which demonstrated that R-loop
formation takes place almost instantaneously after Cascade binding. La última década ha permitido superar los limites de la biofísica a nivel de molélcula individual
y ha abierto nuevos horizontes por medio del desarrollo instrumental. Los esfuerzos
se han centrado en combinar espectroscopía de fuerzas y microscopía de uorescencia, lo
que ha dado lugar a una serie de equipos so sticados que permiten manipular biomoléculas
al mismo tiempo que se pueden visualizar al etiquetarlas con uoróforos. En esta tesis se
han combinado Pinzas Magnéticas y microscopía de Fluorescencia por Re exión Total Interna
(TIRF). Esta combinación ha dado como resultado un sistema que permite aplicar una
fuerza controlada sobre varias moléculas de ADN al mismo tiempo que visualizamos cómo
proteínas marcadas uorescentemente interactúan con ellas. Esta tesis proporciona descripciones
de ambas técnicas, así como detalles sobre el diseño, construcción y experimentos de
caracterización de dicho equipo híbrido, el cual también lleva incorporada tecnología de ujo
laminar multicanal para un intercambio rápido y preciso de reactivos en la muestra.
El equipo se ha aplicado al estudio de los mecanismos de unión y condensación de la
proteína ParB de Bacillus subtilis. ParB está involucrada en el sistema de segregación de
plásmidos de bajo número de copias y es un modelo para la segregación de cromosomas en
muchas bacterias. Aunque su mecanismo de condensación de ADN por medio de formación
de redes se ha descrito anteriormente, su mecanismo de unión sigue siendo desconocido. Esta
tesis ha contribuido a entender su unión al ADN, así como el papel del dominio C-terminal
(CTD) de la proteína en la inhibición de la condensación del ADN. Este novedoso enfoque
experimental ha evidenciado la naturaleza dinámica de ParB, que muestra un intercambio
rápido entre ParB unida a ADN y proteína libre. Además, este estudio del efecto del CTD de
ParB en la unión y la condensación ha permitido validar un modelo en el que el CTD de ParB
bloquea la formación de la red ParB por heterodimerización con la proteína completa, que
permanece unida al ADN.
Un equipo combinado similar se ha empleado en el estudio de Cascade de Streptococcus
thermophilus bajo la supervisión del Prof. Dr. Ralf Seidel en la Universidad de Leipzig,
durante una estancia predoctoral de tres meses. Los sistemas CRISPR-Cas son complejos ribonucleoproteína
de ARN-proteína que constituyen un sistema de inmunidad adaptativa que
protege a los procariotas de los ácidos nucleicos exógenos. La dinámica de la formación de
los llamados ‘R-loop’ ya se ha estudiado a nivel de molécula individual, pero dicho enfoque
experimental carecía de una caracterización de la unión de la proteína o de los cambios conformacionales
previos a la formación del ‘R-loop’. En el presente trabajo de investigación,
el objetivo es obtener datos correlacionados de Pinzas Magnéticas y uorescencia para proporcionar
información sobre el mecanismo de unión de Cascade. Aunque preliminares, los
resultados aquí descritos han ayudado a obtener medidas correlacionadas, lo que ha demostrado
que la formación del ‘R-loop’ tiene lugar casi instantáneamente después de la unión de
Cascade.
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