Visfatina/Nampt y disfunción endotelial in vivo: Mecanismos implicados y modulación farmacológica
Author
Ramos González, MariellaEntity
UAM. Departamento de FarmacologíaDate
2019-03-15Subjects
Nicotinamida Fosforribosiltransferasa - Tesis doctorales; Endotelio - Enfermedades; Farmacia; MedicinaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Farmacología. Fecha de lectura: 15-03-2019Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 15-09-2020
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
La visfatina/Nampt es una proteína pleiotrópica que puede actuar como factor de crecimiento, citoquina o con actividad enzimática nicotinamida fosforibosilltransferasa (Nampt). Es asimismo una adipoquina secretada por el tejido adiposo cuyos niveles plasmáticos se incrementan durante enfermedades cardiometabólicas como la obesidad y diabetes mellitus tipo 2. Además, esta adipoquina tiene un efecto deletéreo vascular en diversas especies, que incluye inflamación y disfunción endotelial. La hipótesis de trabajo es que, en ausencia de cualquier otra situación fisiopatológica, la infusión in vivo de visfatina/Nampt en ratones puede inducir directamente disfunción endotelial e inflamación vascular similares a las observadas en modelos de diabetes mellitus u obesidad.
Ratones C57BL/6 de cuatro meses de edad recibieron durante siete días mediante mini-bombas osmóticas la infusión de suero salino, visfatina/Nampt (100 ng/kg/día), y/o un inhibidor específico de la actividad Nampt (FK866, 2,4 mg/kg/día). Algunos animales recibieron también un bloqueante de los receptores TLR4 (CLI-095, 3 mg/kg/día), un inhibidor del ensamblaje del inflamasoma NLRP3 (MCC950, 10 mg/kg los días 2, 4 y 6) o un antagonista de los receptores para IL-1 (anakinra, 100 mg/kg los días 4, 5 y 6). Tras el sacrificio, las respuestas vasodilatadores dependientes e independientes de endotelio a acetilcolina (ACh; 0,1 nmol/L a 10 μmol/L) o nitroprusiato sódico (SNP; 1 nmol/L a 100 μmol/L), respectivamente, se estudiaron en microvasos mesentéricos aislados. También se realizaron estudios ex vivo con visfatina/Nampt (50 ng/mL) o mononucleótido de nicotinamida (NMN, 10 μmol/L), junto a concentraciones apropiadas de los antagonistas descritos (FK866, 10 μmol/L; CLI-095, 1 μmol/L; MCC950, 100 nmol/L; y anakinra, 100 μg/mL) en microvasos mesentéricos obtenidos de ratones C57BL/6 sin ningún tipo de tratamiento. A partir de lisados de aortas procedentes de ratones infundidos con visfatina/Nampt, se analizaron las proteínas p65 fosforilada (p-p65), un indicador de la activación de NF-B, la enzima pro-inflamatoria iNOS y el inflamasoma NLRP3. De forma similar, los cultivos de células umbilicales humanas cultivadas (HUVEC) fueron expuestos a visfatina/Nampt (25, 50 y 100 ng/mL) para analizar sus efectos en la expresión de la proteína p-p65, así como del inflamasoma NLRP3 y la pro-IL-1, tanto en presencia como en ausencia de FK866 (10 μmol/L), CLI-095 (1 μmol/L) o MCC950 (1 μmol/L).
Los resultados de nuestro trabajo indican que los microvasos mesentéricos obtenidos de ratones infundidos con visfatina/Nampt presentaban disfunción endotelial, con una disminución de las respuestas vasodilatadoras a ACh, pero sin modificación alguna en las inducidas por SNP. Asimismo, se observó un aumento de los marcadores pro-inflamatorios aórticos. La disfunción endotelial se abolió en los animales que recibieron también FK866, CLI-095, MCC950 o anakinra. La administración de visfatina/Nampt ex vivo produjo disfunción endotelial que se revertía por FK866 y CLI-095, pero no por MCC950 o anakinra. En las HUVEC cultivadas, visfatina/Nampt incrementó la expresión de p-p65, el inflamasoma NLRP3 y la pro-IL-1; siendo la expresión de NLRP3 antagonizada por FK966 y CLI-095. La confirmación del papel del inflamasoma en la disfunción endotelial inducida por visfatina/Nampt se obtuvo con el bloqueo de los receptores IL-1 por anakinra que antagonizó el efecto in vivo de visfatina/Nampt, lo que sugería que el efector último del daño vascular era la secreción tisular de IL-1 producto final de la activación del inflamasoma.
En conclusión, la infusión de visfatina/Nampt produce disfunción endotelial in vivo, corroborando su posible papel como mediador del daño vascular asociado a enfermedades cardiometabólicas descrito anteriormente. Además, esta adipoquina parece tener varios mecanismos celulares y moleculares involucrados, incluyendo su actividad enzimática Nampt y la activación del receptor TLR4 mediante la síntesis de NMN, su producto enzimático. Asimismo, se activan vías inflamatorias, como el factor de transcripción NF-B, el ensamblaje del inflamasoma NLRP3 y la secreción de la forma madura de IL-1β de forma paracrina. Es interesante que el daño vascular producido por visfatina/Nampt se previene con CLI-095 y anakinra. Por lo tanto, dianas como los receptores del tipo TLR4 o IL-1 son dianas terapéuticas estratégicas para prevenir las complicaciones vasculares de las enfermedades cardiometabólicas Visfatin/Nampt is a pleiotropic protein acting as growth factor, cytokine, or enzymatic activity nicotinamide phosphoryltransferase (Nampt). It is also an adipokine secreted by adipose tissue whose expression and release are enhanced in obesity and type 2 diabetes mellitus. Visfatin/Nampt is producing vascular deleterious effects by promoting inflammation and endothelial dysfunction. We hypothesize that, in the absence of any other pathophysiological condition, the in vivo infusion of visfatin/Nampt in mice can directly induce vascular inflammation and endothelial dysfunction similar to those observed in models of diabetes mellitus or obesity.
4-month-old C57BL/6 mice were exposed for 7 days to osmotic mini-pump infusion of saline, visfatin/Nampt (100 ng/kg/day), and / or an specific Nampt inhibitor (FK866, 2.4 mg/kg/day). Some animals also received a blocker of TLR4 receptors (CLI-095, 3 mg/kg/day), an inhibitor of NLRP3 inflammasome expression (MCC950, 10 mg/kg on days 2, 4, and 6), or an IL-1-receptor antagonist (anakinra, 100 mg/kg on days 4, 5, and 6). After end-point, endothelium-dependent and independent relaxations to acetylcholine (ACh; 0,1 nmol/L a 10 μmol/L) or sodium nitroprusside (SNP; 1 nmol/L to 100 μmol/L), respectively, were studied in isolated mesenteric microvessels. Studies ex vivo with visfatina/Nampt (25, 50 y 100 ng/mL) or nicotinamide mononucleotide (NMN, 10 μmol/L) with appropriate concentrations of described antagonists (FK866, 10 μmol/L; CLI-095, 1 μmol/L; MCC950, 100 nmol/L; y anakinra, 100 μg/mL) were also performed in mesenteric microvessels from untreated C57BL/6 mice. Phosphorylated protein p65 (p-p65), a marker of NF-B activation, the pro-inflammatory iNOS enzyme, and NLRP3 inflammasome were analysed in aortic homogenates from mice infused with visfatin/Nampt. Similarly, cultured human umbilical endothelial cells (HUVEC), were exposed to visfatin (25, 50 y 100 ng/mL) to analyze its effects on the expression of p-p65, as well as the proteins NLRP3-inflammasome and pro-interleukin (pro-IL)-1β, either with or without FK866 (10 μmol/L), CLI-095 (1 μmol/L), or MCC950 (1 μmol/L).
Our results indicated that the mesenteric microvessels obtained from mice infused with visfatin/Nampt showed endothelial dysfunction to ACh but not changes to SNP. Moreover, an enhancement of aortic pro-inflammatory markers was observed. The endothelial dysfunction was abolished when the animals received also FK866, CLI-095, MCC950, or anakinra. The ex vivo visfatin/Nampt administration induced endothelial dysfunction that was abolished by FK866 or CLI-095, but not by MCC950 or anakinra. In HUVEC cultured, visfatin/Nampt enhanced the expression of p-p65, NLRP3 inflammasome, and pro-IL-1β, these effects being antagonized by FK866 and CLI-095. The confirmation about the role for the NLRP3 inflammasome in the endothelial dysfunction evoked by visfatin/Nampt was that IL-1 receptor blockade by anakinra antagonized the in vivo action of visfatin/Nampt, suggesting that the last effector for vascular damage was the tissular secretion of IL-1β, the final product of inflammasome activation.
We conclude that visfatin/Nampt produce endothelial dysfunction in vivo, consistently with its possible role as mediator of the vascular damage associated to cardiometabolic diseases. This adipokine is presenting several cellular and molecular mechanisms involved, such as the enzymatic Nampt activity and the activation of TLR4 through the synthesis of its enzymatic product NMN. Furthermore, the transcription factor NF-B, the NLRP3 inflammasome expression and the paracrine secretion of mature IL-1β are also involved. Interestingly, the vascular deleterious effects by visfatin/Nampt were prevented by CLI-095 and anakinra. Indeed, targeting IL-1-receptors or TLR4 may represent therapeutic strategies to treat and / or prevent the vascular alterations linked to cardiometabolic diseases.
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